The role of the IRE1/Xbp1 pathway in a Drosophila model for autosomal dominant

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Neurodegenerative disorders are a major medical problem for society. Growing evidence indicates that endoplasmic reticulum (ER) stress is an important common pathological event in a variety of neurodegenerative diseases. The unfolded protein response (UPR) is triggered by the accumulation of misfolded proteins provoked by ER stress conditions, to restore homeostasis. We are particularly interested in the Ire1/Xbp1 branch of the UPR, in which Ire1 mediates the unconventional splicing of Xbp1 mRNA so that Xbp1spliced can activate the transcription of UPR effectors genes. Our aim is to investigate the molecular mechanisms regulating the co-localization of Ire1 with Xbp1 mRNA, which are required for the splicing of Xbp1 mRNA. For this purpose we generated two Ire1-tagged transgenes: 1) in which a mcherry tag is between the transmembrane and the kinase domains of Ire1. 2) Ire1 is fused with a GFP tag in its C-terminal. S2 cell transfections show that our Ire1 constructs are being expressed and correctly localize to the ER. Also, cell transfections suggest that both Ire1 constructs are functionally active, since they are able to splice a Xbp1-EGFP reporter. In parallel, we want to investigate the role of microRNAs (miRNA) in the Xbp1 post-transcription regulation. We started to establish an assay to do miRNA profiling in the context of Ire1/Xbp1 pathway activation. We did preliminary tests where we followed the progression of retinal degeneration induced by light in wt flies or in a ADRP fly model. So far, we could not find the right experimental conditions in which ADRP fly eyes degenerate but control flies do not.As doenças neurodegenerativas constituem um problema emergente na sociedade actual, sendo o stress do retículo endoplasmático (RE) um evento patológico comum a uma variedade destas doenças. Quando ocorre stress no RE, um mecanismo celular denominado unfolded protein response (UPR) é activado, pela acumulação de proteínas misfolded, para que a célula possa restaurar a homeostasia. O UPR leva a uma diminuição da tradução de proteínas clientes do RE e a um aumento da capacidade de lidar com proteínas misfolded, o qual ocorre pela activação da transcrição de uma série de genes do RE, como por exemplo, as chaperones. Paralelamente, o UPR tem também como consequência a activação da via de degradação associada ao RE, que degrada proteínas com folding incorrecto, através do sistema de ubiquitina-proteossoma. Em conjunto, os mecanismos activados pelo UPR permitem restabelecer o funcionamento do RE. Contudo, nos casos em que o stress no RE é severo e prolongado, o UPR pode não ser suficiente para contrabalançar os seus efeitos. Nestes casos, são desencadeadas vias de sinalização que culminam na morte celular programada – a apoptose. O UPR é iniciado por transdutores transmembranares do RE que conseguem reconhecer a acumulação de proteínas misfolded no lúmen do RE. Existem três transdutores: o inositol-requiring enzyme 1 (Ire1), o pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase (PERK) e o activating transcription factor 6 (ATF6), que activam três ramos do UPR, mecanicamente distintos. O Ire1 é o mais conservado destes transdutores, uma vez que está presente em todos os eucariotas. Nos metazoários, depois de activado, Ire1 catalisa a remoção de um intrão do mRNA de X-box binding protein 1 (Xbp1) – um mecanismo de splicing independente do spliceosoma. Quer a forma spliced, quer a forma unspliced do mRNA de Xbp1 são traduzidas e originam proteínas, mas apenas a forma spliced de Xbp1 origina um factor de transcrição eficiente, que activa a expressão de genes-alvo do UPR a jusante. A remoção do intrão de Xbp1 causa um frameshift durante a tradução, que introduz um novo domínio C-terminal na proteína, o qual é essencial para função desta como factor de transcrição. A Retinite Pigmentosa (RP) é uma doença caracterizada pela degeneração progressiva dos fotorreceptores, tendo como principais sintomas a cegueira nocturna, seguida pela perda da visão periférica e, numa fase mais avançada, pela perda da visão central. Utilizando um modelo em Drosophila melanogaster de RP, conclui-se que a via de sinalização de Ire1/Xbp1 tem um papel relevante na protecção contra a degeneração da retina. Assim, mais estudos sobre a regulação da via de sinalização de Ire1/Xbp1 poderão permitir uma melhor compreensão da RP. Neste trabalho, estivemos particularmente interessados na via de sinalização de Ire1/Xbp1 do UPR, tendo dois objectivos principais de estudo. 1. O primeiro objectivo foi o de estudar em Drosophila o fenómeno de co-localização do Ire1 e do mRNA de Xbp1. Uma vez que Ire1 é uma proteína transmembranar do RE, para que se possa realizar o splicing do mRNA de Xbp1 é necessário que este último, de alguma forma, seja recrutado para a vizinhança do RE. Investigações recentes sugerem diferentes modelos para a co-localização de Ire1 e do mRNA Xbp1. De acordo com o estudo em levedura de Aragon et al, sempre que as células estão sob condições de stress, Ire1 “oligomeriza-se” e acumula-se em foci na membrana do RE. O mRNA Hac1 (o homólogo funcional de Xbp1 na levedura) é então recrutado por intermédio de um elemento bipartido presente no 3' untransleted region (UTR) para estes foci. Já Yanagitani et al argumentam que a pausa na tradução de Xbp1 unspliced é que é necessária para o recrutamento (por intermédio de uma região hidrofóbica denominada HR2) e para o splicing do mRNA de Xbp1 em células de mamíferos. Em Drosophila, foi identificada uma região HR2 mas a sua funcionalidade ainda não foi comprovada. O fenómeno de co-localização do Ire1 e do mRNA de Xbp1 continua por explorar. Neste trabalho, originámos dois transgenes de Ire1 fundidos com uma cauda fluorescente, de modo a ser possível a sua visualização em microscopia confocal. Num dos transgenes, foi inserida uma cauda mcherry entre o domínio transmembranar e o domínio cinase da proteína Ire1. No outro caso, uma cauda GFP foi fundida na extremidade C-terminal de Ire1. Seguidamente, estas construções foram clonadas em vectores pUAST e transfectadas em células S2 para podermos avaliar se elas seriam expressas na célula, se se localizariam correctamente e se estariam funcionais. As transfecções efectuadas mostraram que as nossas construções de Ire1 foram expressas pelas células e localizavam-se, como esperado, no RE. Além disso, as transfecções também sugeriram que as construções de Ire1 são funcionais, já que realizaram o splicing do repórter Xbp1-EGFP. No entanto, para que possamos ter a certeza que as nossas construções são viáveis, estes resultados precisam de ser repetidos e ser validados no organismo da Drosophila. 2. O segundo objectivo de estudo foi o de investigar a regulação pós-transcricional de Xbp1, mais concretamente, de analisar se os miRNA podem ter uma função neste processo. A regulação pós-transcricional relativamente à estabilidade, à tradução e à localização do mRNA é muito importante para um rápido controlo da expressão génica. Este tipo de regulação exige que se liguem ao mRNA proteínas de ligação ao RNA (RNA binding proteins - RBPs) e microRNAs (miRNAs). A regulação pós-transcricional da via de sinalização de Ire1/Xbp1 precisa de ser um fenómeno rápido para que o controlo de qualidade do RE não seja comprometido. De facto, os níveis de Xbp1 spliced parecem ser rigorosamente controlados para que as células ajustem rapidamente a sua resposta e recuperarem do stress no RE. Apesar disto, nunca foi investigado o envolvimento dos miRNAs e RBPs no contexto da vida de sinalização de Ire1/Xbp1, pelo que nos propusemos fazê-lo. Com o intuito de investigar a regulação pós-transcricional de Xbp1, nós pretendemos fazer um levantamento da expressão de miRNAs no âmbito da degeneração dos fotorreceptores, utilizando o modelo em mosca de Retinite Pigmentosa Autossómica Dominante (Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa - ADRP) que temos no laboratório. Para tal, neste trabalho, decidimos tentar estabelecer um ensaio onde fosse possível estudar o perfil de miRNAs no contexto da via de sinalização de Ire1/Xbp1. Tendo em conta toda a variedade de factores envolvidos na degeneração de fotorreceptores da mosca, foi necessário fazer alguns testes preliminares que acompanharam o desenvolvimento da degeneração da retina induzida pela luz em moscas wt ou no nosso modelo de mosca de ADRP. Até à data, não foi possível encontrar as condições experimentais adequadas para o ensaio pretendido: a não degeneração dos olhos das moscas wt e a degeneração dos olhos das moscas do nosso modelo de ADRP. Ainda assim, vamos prosseguir com este trabalho, repetindo os testes preliminares com uma população maior e com parâmetros mais controlados. Planeamos ainda tentar encontrar alternativas ao ensaio que estamos a desenvolver, utilizando uma estratégia menos complexa. Cumpre dizer que relativamente a ambos os objectivos, o trabalho aqui descrito representa o início de um estudo que pretendemos continuar no futuro, no sentido de esclarecer qual o modelo de co-localização de Ire1 e do mRNA de Xbp1 na célula e quais os factores implicados na regulação pós-transcricional de Xbp1