Investigating the oligodendrocyte progenitor cells and their progeny heterogeneity in the mammalian central nervous system

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Oligodendrocytes (OLs) are macroglial cells present in the vertebrate central nervous system (CNS). OLs are responsible for myelinating the neurons, ensuring an efficient propagation of electrical impulses along the axon, through saltatory conduction. Myelination disorders, such as multiple sclerosis, damage the myelin sheath and disrupt the normal performance of neurons. When this kind of event happens, OLs have the capability of remyelinating the affected axons for a certain period. Oligodendrocytes are originated by oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), which are highly proliferative, as identified by the expression of the specific molecular marker platelet-derived growth factor receptor alpha (Pdgfra). OPCs proliferate in three phased developmental waves from different domains in the ventricles of the developing brain and spinal cord, giving rise to twelve distinct subpopulations of OLs. These proliferation waves occur in distinct time-points, namely on embryonic (E) days 13.5 and 15.5, and gradually throughout a postnatal (P) wave that starts at birth. Bulk and single-cell RNA-seq analysis performed by the host laboratory suggests that OPCs and OLs present a high degree of heterogeneity at transcriptional level: the gene expression profile of OPCs and progeny varies dramatically during development between and within different areas of the CNS. Thus, it was possible to identify putative cell markers for the twelve different OL subpopulations. To validate these markers in tissue sections, antibodies and RNA probes were tested through immunohistochemistry (IHC) and RNAscope in situ hybridization (ISH), respectively. Since the proliferation waves of OPCs occur in three different time points, the developmental origin of the distinctive OL subpopulations was also investigated both in the brain and spinal cord. This subject was addressed by conducting lineage tracing experiments using the PdgfrCreER-RCE mouse line, tagging GFP (green fluorescent protein) reporter with OPCs and their progeny. Recombination of the reporter gene was induced either on E12.5 or P3-5, in order to respectively target the first embryonic and postnatal waves of OPC proliferation and their progeny. Subsequently, brain and spinal cord were collected at different ages (P20 and P60), and IHC and ISH assays were performed to test the putative markers for different subpopulations of OL lineage. In this work, the pattern of expression of antibodies/probes for cellular markers of OL subpopulations was analysed: MOL1 and MOL2 in the juvenile mouse, and MOL5/6, OPCs/COP in the adult mouse. Moreover, colocalization of signal between diverse cellular markers for OL lineage was assessed in the adult mouse, targeting the embryonic and postnatal waves of OPC proliferation and progeny. The results presented in this work contribute for a broader comprehension regarding OL lineage heterogeneity, as well as their developmental origin in the CNS of the mouse.O sistema nervoso é uma complexa rede de células especializadas que comunicam entre si, permitindo ao organismo adquirir e partilhar informação sobre o próprio e o que o rodeia. Isto envolve componentes sensoriais que detectam estímulos ambientais, e componentes motores que comandam os diferentes músculos, bem como secreções glandulares. A rede que constitui o sistema nervoso é composta por neurónios e células especializadas, denominadas células da glia, ou simplesmente glia. A sinalização entre estes diferentes tipos celulares permite a realização de processos cognitivos como o pensamento, comunicação, aprendizagem e formação de memórias, e também a movimentação e sensação. Isto permite a percepção e interação com o mundo, outros indivíduos e si mesmo, moldando o próprio comportamento. Ao longo do desenvolvimento do sistema nervoso, factores de crescimento irão induzir a formação da espinal medula, posteriormente levando à origem do cérebro. A proliferação e diferenciação de células estaminais neurais, que são multipotentes, levará à geração de neurónios e glia no sistema nervoso. Os neurónios são o componente básico para o funcionamento do cérebro, espinal medula e nervos periféricos, sendo o principal tipo celular do sistema nervoso. Estas células comunicam entre si através da condução de impulsos nervosos ao longo do axónio e graças à existência de conexões entre si, denominadas sinapses. Para além disso, as célula da glia têm também papéis cruciais para o correto funcionamento do sistema nervoso central (SNC), incluindo protecção imunológica no caso da microglia, suporte metabólico e recaptação de neurotransmissores no caso dos astrócitos, e os oligodendrócitos são responsáveis pela mielinização dos neurónios. Os oligodendrócitos (OLs) interagem com axónios adjacentes, através da projeção de diversos processos celulares, envolvendo-os em mielina. A bainha de mielina fornece suporte aos neurónios e facilita a propagação de impulsos eléctricos de forma rápida e eficiente, através de condução saltatória. Tendo em conta que a mielinização neuronal está relacionada com aspectos comportamentais, cognitivos e emocionais, este trata-se de um processo crucial para o correto funcionamento do cérebro humano. Um dos aspectos mais característicos da mielinização é que começa no estado embrionário e estende-se após o nascimento, em humanos ao longo das duas primeiras décadas de vida, e em ratinho até aos dois meses. No entanto, a produção de mielina também pode acontecer noutras alturas da vida, nomeadamente em contexto de doenças que comprometam o funcionamento dos OLs ou danifiquem as bainhas de mielina já existentes, como é o caso da esclerose múltipla. Cada OL tem a capacidade para mielinizar cerca de 60 axónios distintos, dependendo do área do SNC e diâmetro dos axónios. Os OLs são originados por células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs), que são altamente migratórios, como identificado pela expressão dos marcadores moleculares específicos proteoglicano NG2 e platelet-derived growth factor receptor alfa (Pdgfra). Ao longo do desenvolvimento e durante episódios de remielinização a linhagem dos OLs diferencia-se progressivamente e de forma altamente regulada. Estes processos são controlados por uma multitude de factores moleculares intrínsecos e extrínsecos, que induzem alterações epigenéticas e regulação transcricional e traducional em OPCs e OLs, orquestrando assim a produção de mielina. A origem dos OPCs ocorre em ondas de proliferação sequenciais, provenientes de domínios dorsais e ventrais do cérebro e espinal medula em desenvolvimento. Em ratinho, a primeira onda de produção de OPCs ocorre sensivelmente no dia embrionário (E) 13.5, seguido por uma segunda onda no dia E15.5. Uma terceira, e última, onda de proliferação ocorre após o nascimento, e gradualmente ao longo de alguns dias. Experiências de fate-mapping demonstram que na espinal medula os OPCs têm fundamentalmente origens ventrais, contribuindo em 85-90% para a origem de OLs no ratinho adulto. Por outro lado, no cérebro, a primeira onda de proliferação de OPCs é essencialmente reposta por precursores originados de zonas mais dorsais, numa fase posterior do processo de desenvolvimento. Curiosamente, a ablação génica de células precursoras tanto de origem ventral como dorsal resulta numa expansão compensatória da população contrária, originando um número final de OLs e níveis de mielinização normais, o que demonstra um grande grau de redundância. Para além disto, os OPCs são também capazes de comunicar com neurónios, através de potenciais de ação, demonstrando funcionalidade equivalente em OPCs originados tanto de zonas ventrais como dorsais. Apesar de a população de OLs aparentar ser altamente homogénea na sua função, os OPCs estão aptos a gerar OLs com potencial de mielinização heterogéneo. No caso da espinal medula, os OLs produzem bainhas de mielina mais espessas e os segmentos internodais nos axónios são mais longos, contrariamente aos OLs corticais. Para além disso, OPCs da matéria branca diferenciam-se em OLs mielinizantes quando transplantados tanto para matéria branca como cinzenta, o que não acontece com OPCs da matéria cinzenta, gerando menos OLs produtores de mielina mesmo quando transplantados para matéria branca. Assim, é preciso clarificar se os OLs se tornam morfologicamente diversificados ao longo da maturação, através de interações com o meio envolvente, ou se possuem heterogeneidade funcional intrinsecamente. A esclerose múltipla é uma doença crónica autoimune no sistema nervoso central, caracterizada por surtos de desmielinização neuronal com diversos níveis de gravidade. Julga-se que seja causada por diversos factores, nomeadamente susceptibilidade genética, infeção viral, desestabilização no metabolismo e fatores ambientais. Carateriza-se pela perda de força muscular, alterações na coordenação e sensibilidade, visão enevoada e dificuldades no discurso. Normalmente é desencadeada entre os 20 e os 45 anos de idade e, de momento, não tem cura. Na maioria dos pacientes, a esclerose múltipla apresenta estádios iniciais de deficits neurológicos reversíveis, quando os sintomas abrandam ou desaparecem, o que corresponde a uma resposta remielinizante dos OPCs. No entanto, ao longo do tempo os OPCs vão perdendo a capacidade de responder de forma eficiente até que acabam por perder a sua função na totalidade. Este padrão designa-se relapse-remitting e é o subtipo mais comum da doença. A remielinização normalmente segue-se a uma perda patológica de mielina, de forma a restaurar as propriedades dos neurónios através da produção de novas bainhas de mielina. Este é um processo complexo que envolve factores celulares e moleculares na sua regulação. Numa fase inicial as áreas afectadas são colonizadas pelos OPCs, que depois se diferenciam em OLs mielinizantes, que contactam com os axónios afectados e produzem novas bainhas de mielina funcionais. Foi demonstrado anteriormente que o transplante de OPCs no SNC origina oligodendrogénese e consequente remielinização axonal. Desta forma, os OPCs são a população celular que deve ser focada para o desenvolvimento de novas terapias para doenças desmielinizantes. Análise de sequenciação de RNA (RNA-seq) em bloco e célula a célula, sugere que os OPCs e OLs possuem um elevado grau de heterogeneidade a nível transcricional. Foram analisados 5072 transcriptomas de células singulares, isolados de 10 regiões específicas do SNC de ratinho juvenil e adulto, sendo identificadas 12 subpopulações distintas da linhagem de OLs. Foi também possível criar um modelo de diferenciação, partindo dos OPCs e identificando as diversas fases dos OLs até atingirem o estado maduro. A existência destes estados distintos de OPCs e OLs sugerem uma possível heterogeneidade funcional. Assim, foi também possível criar uma lista de marcadores celulares putativos para a identificação das diferentes subpopulações de OLs presentes no cérebro e espinal medula do ratinho. De forma a validar estes marcadores em secções de tecido do SNC de ratinho, usaram-se anticorpos e sondas de RNA, testados respetivamente através de técnicas de imunohistoquímica (IHC) e hibridização in situ (ISH). Para além disso, e tendo em conta que as ondas de proliferação de OPCs ocorrem em três fases distintas, também se procedeu à investigação da origem do desenvolvimento das diferentes subpopulações de OLs, tanto no cérebro como na espinal medula. Estes estudos foram feitos recorrendo a lineage tracing, utilizando a linhagem de ratinho PdgfraCreER-RCE, induzindo, através de injeções de tamoxifeno, a expressão do gene repórter GFP (green fluorescent protein) nos OPCs e respetiva descendência. Induziu-se a recombinação expressão de GFP nos dias 12.5 do estado embrionário ou 3-5 após o nascimento do ratinho, pondo em evidência respetivamente a primeira ou última ondas de proliferação de OPCs e descendência. Subsequentemente, o cérebro e espinal medula foram recolhidos em idades distintas, nomeadamente no ratinho juvenil (20 dias) e adulto (60 dias), e realizaram-se ensaios de IHC e ISH. Neste trabalho foi analisado o padrão de expressão de marcadores celulares, através da utilização de anticorpos/sondas específicos, de subpopulações de OLs: MOL1 e MOL2 no ratinho juvenil, e MOL5/6, OPCs/COP no ratinho adulto. Procedeu-se ainda à análise de co-localização de sinal entre diversos marcadores celulares da linhagem de OLs no ratinho adulto. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem para uma maior compreensão sobre a heterogeneidade da linhagem de OLs, bem como a sua origem ao longo do desenvolvimento do SNC do ratinho. A aquisição desta informação poderá ser útil no sentido de melhor compreender as alterações moleculares e de diferenciação de OPCs e OLs em eventos de remielinização em contexto de doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla