Cytoadherence capabilities of Plasmodium berghei ANKA and NK65 infected red blood cells in different malaria models

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências. 2011Malaria is an infectious disease caused by an intracellular parasite (genus Plasmodium). Sequestration of mature erythrocytic forms of P. falciparum is a key factor in the development of severe malaria-associated pathologies, namely CM. Brains of patients that died of CM show a preferential sequestration of the MF, and blood-smears of malaria patients at hospital admission show exclusively immature erythrocytic forms. Recently, it was demonstrated that in PbA-infected C576BL/6 mice, an experimental cerebral malaria model, there is accumulation of pRBCs in the brain, as well as CD8+T cells. On the contrary, PbA-infected Balb/C mice, which don‟t develop ECM, don‟t accumulate these cell-populations. PbNK65-infected C57BL/6 mice also don‟t develop ECM, though they accumulate CD8+T cells in the brain, but not infected erythrocytes. Using these models of malaria, our main goal was to study the blood-stage dynamics and sequestration capabilities of both parasite strains and associate that pattern with the pathology. Results show that MF of both parasite strains are not seen in circulation at a certain point in infection. Also, this disappearance from circulation is concomitant with sequestration of PbA schizonts in the spleen and lungs (C57BL/6 mice), as well as in the fat tissue and liver (both hosts). In addition, we wanted to clarify the importance of parasite versus host in cytoadherence of pRBCs to the brain microvasculature. Our results suggest that the absence of PbNK65 sequestration in the brain of C57BL/6 mice is mainly due to differences between this parasite and PbA in its intrinsic cytoadherence capability. Moreover, we observed a significant difference in numbers of merozoites formed per schizont between PbNK65 and PbA infections, which might account for the differences in parasitaemia growth rates and infectivity that have been described for these strains.A malária é uma doença infecciosa responsável por mais de 225 milhões de infecções e 781 000 mortes por ano, a grande maioria de crianças até aos 5 anos de idade [1]. O seu impacto faz-se sentir não só a nível social, mas também a nível económico, sendo umas das causas da perpetuação do ciclo de pobreza que é vivido nos países afectados por esta doença [2]. A malária é causada por um parasita eucariota intracelular, do género Plasmodium, transmitido através da picada de um mosquito do género Anopheles, que pode infectar mamíferos, répteis e aves. No Homem, a malária pode ser decorrente da infecção por cinco espécies diferentes: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi [3]. Os parasitas do género Plasmodium têm um ciclo de vida complexo que se divide entre a fase sexuada, no vector invertebrado, e a fase assexuada, no mamífero. A infecção inicia-se quando o mosquito se alimenta de sangue de um mamífero e deposita na sua derme os esporozoítos [4]. Estes entram na corrente sanguínea, através da qual migram até atingir o fígado, onde irão dar início à fase hepática da infecção, clinicamente silenciosa. Dentro dos hepatócitos, cada esporozoíto irá desenvolver-se, dando origem a milhares de outros parasitas – merozoítos. Estes acabarão por sair da célula-hospedeira em grupos de uma a duas centenas, em vesículas envoltas por membranas do próprio hepatócito [5, 6], chamadas merosomas. Os merosomas entram na corrente sanguínea [5] e tendem a acumular-se a nível dos alvéolos pulmonares [6], onde irão lisar e libertar os merozoítos. Estes infectam eritrócitos, dando início à fase sanguínea da infecção, a fase sintomática da malária [6]. Dentro dos glóbulos vermelhos, o parasita aumenta de tamanho, desenvolvendo-se da forma imatura, em anel, até ao trofozoíto. Nesta fase, o parasita continua a aumentar de tamanho, iniciando-se a replicação de DNA e a produção de cristais de hemozoína, como resultado da digestão da hemoglobina da célula-hospedeira [7]. O momento de passagem a esquizonte dá-se quanto se inicia a esquizogenia. Este processo consiste num conjunto de mitoses assimétricas e assíncronas consecutivas que dão origem a múltiplos parasitas (merozoítos) dentro do eritrócito infectado [8]. Os merozoítos, aquando da lise da célula-hospedeira, libertam-se na corrente sanguínea e infectam outros eritrócitos, dando assim início a um novo ciclo de desenvolvimento sanguíneo. Durante a fase sanguínea, alguns parasitas intraeritrocíticos podem diferenciar-se em gametócitos femininos e masculinos, em resposta a stress ou outros factores. Os gametócitos, ao serem ingeridos por um mosquito numa refeição de sangue, sofrem fusão meiótica e um complexo processo de desenvolvimento que culmina na acumulação de esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito. Estes podem ser introduzidos no hospedeiro mamífero na próxima refeição de sangue, assegurando assim a perpetuação da espécie [9]. As formas sanguíneas maturas (FSM) de P. falciparum podem ser sequestradas em vários órgãos [10] e esta característica está associada ao grau de severidade da doença [11]. A capacidade de citoaderência tem vindo a ser considerada um factor-chave no desenvolvimento de patologias severas associadas à malária, nomeadamente no desenvolvimento de malária cerebral (MC) [12, 13]. No cérebro de doentes que morreram de MC há sequestração prefencial das FSM, e os parasitas encontrados nos esfregaços de sangue de pacientes que deram entrada em hospitais com malária severa apresentam exclusivamente formas imaturas em anel [10]. Ratinhos C57BL/6 infectados com P. berghei ANKA (PbA) são o modelo de MC mais usado. Foi recentemente demonstrado neste modelo a sequestração de eritrócitos parasitados (EP) no cérebro, assim como de células T CD8+, durante o desenvolvimento da patologia [14]. No entanto, ratinhos Balb/C infectados com o mesmo parasita não desenvolvem malária cerebral experimental (MCE). Foi descrito que no cérebro destes ratinhos não ocorre sequestração, nem de células T CD8+, nem de EP [14]. Curiosamente, ratinhos C57BL/6 infectados com P. berghei NK65 também não desenvolvem MCE nem sequestram EP, embora sequestrem células T CD8+ no cérebro [14]. Não é ainda claro se, durante a MCE, as FSM são as únicas que sequestram ou se estão presentes em circulação, tal como na MC humana. Usando os modelos murinos de malária referidos acima, o objectivo principal deste trabalho é o estudo da dinâmica das formas sanguíneas e a capacidade de citoaderência das duas estirpes de P. berghei, e a sua possível relação com sinais de doença observados nestes animais. Os nossos resultados mostram que, nas combinações de parasita-hospedeiro estudadas, as FSM de PbA e de PbNK65 dimiminuem proporcionalmente em circulação, em determinados fases da infecção in vivo e voltam a aumentar em proporção mais tarde na infecção. Para determinar se o desaparecimento de circulação das FSM de PbA é devido à sua sequestração em algum órgão ou à eliminação do parasita no baço, infectámos ratinhos C57BL/6 ou Balb/C com uma linha de PbA que expressa uma proteína de fusão, a Luciferase-GFP, apenas nas FSM. Em diferentes fases da infecção, e após perfusão para eliminar os parasitas circulantes, determinados órgãos foram extraídos (baço, fígado, pulmões e tecido adiposo) e o conteúdo em luciferase foi determinado por técnicas de bioimagiologia. Os nossos resultados mostram que as FSM de PbA sequestram a nível do baço e dos pulmões (nos ratinhos C57BL/6 infectados), assim como no tecido adiposo e fígado (em ambos os hospedeiros), sequestrando proporcionalmente muito mais no baço e no tecido adiposo. Esta sequestração é concomitante com uma diminuição da proporção destas formas em circulação. É de referir que os baços de ratinhos Balb/C eram mais escuros e de maiores dimensões do que os baços de ratinhos C57BL/6, o que pode indicar um maior conteúdo em hemozoína e uma maior proliferação celular. Isto sugere uma maior eliminação do parasita pelo baço nos ratinhos Balb/C comparativamente com os ratinhos C57BL/6. No entanto, a quantidade de esquizontes viáveis sequestrados é significativamente inferior nos ratinhos Balb/C do que nos ratinhos C57BL/6. Pretendíamos também esclarecer a importância relativa do parasita versus hospedeiro na citoaderência de EP à microvasculatura cerebral, durante o desenvolvimento de MC. Especificamente, pretendíamos perceber se a ausência de sequestração de EP de PbNK65 no cérebro de ratinhos C57BL/6 é devida à incapacidade destes EP aderirem ao endotélio activado, ou se poderão haver diferenças no micro-ambiente gerado no cérebro em resposta ao parasita que possam explicar esse fenótipo. Para isso, co-infectámos ratinhos C57BL/6 com PbNK65-GFP e PbA. Usando PCR-quantitativo em tempo real, medimos a expressão de GFP (e portanto a presença do parasita PbNK65) nos cérebros destes ratinhos, na fase final de MC. Os nossos resultados sugerem que os EP por PbNK65 não são sequestrados no cérebro de ratinhos C57BL/6, devido à sua incapacidade intrínsica de aderir ao endotélio activado. Este projecto pretendia clarificar a dinâmica das formas circulantes e a capacidade de citoaderência de duas estirpes de P. berghei, e a forma como estes padrões se podem correlacionar com a patologia. Os resultados não são conclusivos e mais experiências têm de ser realizadas para elucidar este assunto. No entanto, consideramos que indiciam diferenças entre os mecanismos de sequestração no cérebro em relação a outros órgãos, de PbA, assim como de PbNK65. Os nossos resultados também sugerem que existem diferenças intrínsecas ao parasita na capacidade de citoaderência de EP por PbA versus EP por PbNK65 à microvasculatura cerebral. Além disto, observámos uma diferença significativa no número de merozoítos formados por cada esquizonte, entre a infecção sanguínea por PbA e por PbNK65. Sugerimos que este facto pode estar na origem das diferenças já descritas [15] entre as duas estirpes de P. berghei no que diz respeito à taxa de crescimento de parasitémia e infecciosidade