Novos alvos e abordagens terapêuticas em doenças hereditárias do metabolismo

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013Inherited metabolic disorders (IMDs) are rare autosomal recessive disorders, showing a high allelic and phenotypic heterogeneity. The main therapeutic goal in these disorders is to restore the metabolic balance and, until now, most available therapies are not definitive and only alleviate the patients’ symptoms. In this work, three IMDs were analyzed, two organic acidurias, propionic and methylmalonic acidurias, and one aminoacidopathy, pyruvoyltetrahydropterin synthase. Organic acid disorders or organic acidurias (OAs) are characterized by the excretion of non-amino organic acids in urine. Two of the most common OAs are propionic and methylmalonic acidurias. These two disorders are caused by defects in the oxidation pathway of propionyl-CoA into succinyl-CoA that enters the tricarboxylic acid cycle. Propionic aciduria is caused by mutations affecting the PCCA or PCCB genes that encode the subunits of the propionyl-CoA carboxylase enzyme, while methylmalonic aciduria is caused by mutations affecting not only the MUT gene but also the genes encoding the proteins involved in the trafficking and synthesis of the enzyme cofactor, adenosylcobalamin (AdoCbl). Until now, 9 different complementation groups have been identified, but only four, mut, cblA, cblB and cblD variant 2 are responsible for a phenotype of isolated methylmalonic aciduria. Pyruvoyltetrahydropterin synthase deficiency is caused by defects in the PTS gene that encodes the enzyme pyruvoyltetrahydropterin synthase (PTPS), which catalyzes the second step of the de novo tetrahydrobiopterin (BH4) synthesis. In this work four methylmalonic cblD variant 2 type, one methylmalonic mut type and two propionic patients of Spanish and Portuguese origin were genetically characterized, revealing the presence of three novel (c.165_166del2, c.170G>A and c.10-1G>C) and one already described (c.57_64del8) mutations in cblD variant 2 type patients, two novel mutations (c.244dupA and c.1408-10A>G) in the mut type patient and two already described mutations (c.1218del14ins12 and c.183+3G>C) in the propionic patients. The functional analysis of three missense mutations (p.His183Leu, p.Arg186Trp and p.Glu193Lys), and two in-frame mutations (p.Ile117_Gln118del and p.Arg190dup) affecting the MMAB gene (cblB complementation group) revealed that all are disease causing, since the inframe mutations are responsible for a complete lack of immunoreactive protein, while the missense mutations affect protein folding and stability. The p.His183Leu and p.Arg190dup are novel mutations and were identified in two siblings presenting phenotypic differences. Analysis of these patients using a customized highresolution comparative genomic hybridization assay (Metaboloarray®) and the analysis of the MMAB gene promoter regions did not reveal any other changes, while the analysis of fibroblasts derived from the patients revealed low protein levels when compared with controls, and also differences in the protein levels between the siblings. The study of the mitochondrial protein quality control revealed elevated levels of mitochondrial Hsp70 in both patients and reduced Lon protease levels in one of the siblings. Analysis of the mitochondrial function in these two cblB type patients, and also in two mut type patients, revealed mitochondrial impairment in all patients and, most importantly, a correlation between mitochondrial impairment and the phenotypic differences observed in the cblB type patients. Finally, two different therapeutic approaches were assessed. The use of a pharmacological chaperone, in vitro upon missense mutations (p.His183Leu, p.Arg186Trp and p.Glu193Lys) affecting MMAB gene, and also in vivo, upon the wild-type protein. In vitro treatment with compound V increased the mutants’ stability, and the in vivo treatment stabilized the wild-type protein in brain and liver without toxic effects. A comparison of the stabilizing effect of the pharmacological chaperone and hydroxocobalamin (OHCbl) was also performed, showing a synergistic effect of both compounds upon the stability of wild-type and p.Ile96Thr mutant proteins in a cellular model. The antisense therapy targeting pseudoexon inclusion in PTPS deficient patients was tested, and successfully restored the normal PTS splicing profile, immunoreactive protein levels, enzymatic activity and metabolic pathway in the three patients analyzed. The results obtained with this work allowed the expansion of the known mutational spectrum in isolated methylmalonic aciduria, the characterization of novel mutants, as well as the identification of novel therapeutic targets.As Doenças Metabólicas Hereditárias (DHMs) são doenças raras, transmitidas na sua maioria de forma autossómica recessiva, e que afetam o metabolismo intermediário. Embora a frequência individual de cada DHM seja baixa, quando analisadas no seu conjunto, estas doenças afetam cerca de 8% da população europeia. As DHMs caracterizam-se por uma elevada heterogeneidade fenotípica e, até ao momento, as opções terapêuticas não corrigem as causas e apenas aliviam a sintomatologia dos doentes. Os recentes avanços científicos ampliaram o conhecimento das bases genéticas bem como da patofisiologia subjacente às DHMs, permitindo a procura e identificação de novas abordagens terapêuticas. A classificação das DHMs é feita de acordo com a via metabólica afetada. Neste trabalho foram estudadas duas acidúrias orgânicas, acidúria propiónica e metilmalónica e uma aminoacidopatia, deficiência no enzima 6-piruvoil-tetrahidropterina sintase (PTPS). As acidúrias propiónica e metilmalónica são duas das acidúrias orgânicas mais comuns e são causadas por defeitos na via metabólica que catalisa a oxidação do propionil-CoA em succinil-CoA, um intermediário do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. A acidúria propiónica é causada por mutações nos genes PCCA ou PCCB que codificam as subunidades do enzima propionil-CoA carboxilase (PCC). Este enzima é responsável pela carboxilação do propionil-CoA em D-metilmalonil-CoA. Os doentes afetados apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas caracterizado por acidose metabólica, cetose, hipoglicémia e hiperamonémia devido à acumulação de ácido propiónico e à depleção dos níveis de carnitina. O diagnóstico bioquímico consiste na deteção de níveis urinários elevados de 2-metilcitrato, ácido propiónico e 3-hidroxi-propionato, entre outros metabolitos, sendo a confirmação do diagnóstico realizada através de estudos enzimáticos ou de caracterização genética. O tratamento destes doentes passa pela restrição alimentar de aminoácidos percursores do propionil-CoA, administração de carnitina, biotina e cabamilglutamato, e também de metronidazol para reduzir a produção de propionato pela flora intestinal. Por sua vez, a acidúria metilmalónica pode ter diversas causas: mutações no gene MUT que codifica o enzima metilmalonil-CoA mutase (MUT), responsável pela síntese de succinil- CoA a partir de L-metilmalonil-CoA, ou mutações em genes que codificam as proteínas responsáveis pela síntese e transporte do cofactor, adenosilcobalamina. Até ao momento, foram identificados 9 grupos de complementação distintos, de acordo com as proteínas afetadas e o fenótipo apresentado pelos doentes, mas apenas quatro, mut, cblA, cblB e cblD variante 2, são responsáveis por um fenótipo de acidúria metilmalónica isolada. O grupo de complementação cblA é causado por mutações no gene MMAA, enquanto mutações no gene MMAB são responsáveis pelo grupo cblB. O grupo de complementação cblD variant 2 é causado por mutações nos exões iniciais do gene MMADHC. O diagnóstico de acidúria metilmalónica consiste na determinação de perfis metabólicos, em estudos enzimáticos e, finalmente, na caracterização genética. Estes doentes apresentam níveis elevados de ácido metilmalónico, 3-hidroxipropionato, 2-metilcitrato, lactato, propionilglicina e creatinina, tanto na urina como no plasma. O tratamento destes doentes passa também pela restrição alimentar, administração de vitamina B12 e carbamilglutamato, bem como suplementação com carnitina. Mutações no gene PTS causam deficiência do enzima PTPS, responsável pela catálise do segundo passo da via de síntese de novo da tetrahidrobiopterina (BH4). Estes doentes podem apresentar três fenótipos clínicos, classificados de acordo com a gravidade apresentada: central (deficit de BH4 e neurotransmissores no sistema nervoso central e órgãos periféricos), periférico (deficit de BH4 e neurotransmissores nos órgãos periféricos) e transitório. Neste trabalho, realizou-se a caracterização molecular de vários doentes de origem espanhola e portuguesa: quatro doentes com acidúria metilmalónica pertencentes ao grupo cblD variante 2, um doente metilmalónico pertencente ao grupo mut e dois doentes com acidúria propiónica. Os resultados levaram à identificação de três mutações novas (c.165_166del2, c.170G>A e c.10-1G>C) e uma mutação já descrita (c.57_64del8) nos doentes tipo cblD variante 2, duas mutações novas (c.244dupA e c.1408-10A>G) no doente tipo mut e duas mutações já descritas (c.1218del14ins12 e c.183+3G>C) nos doentes propiónicos. Todas as mutações identificadas foram caracterizadas, tendo os resultados revelado que são muito provavelmente patogénicas e responsáveis pelo fenótipo clínico observado nos doentes. A caracterização funcional das mutações no gene MMAB, que codifica o enzima adenosilcobalamina transferase (ATR), responsável pela síntese do cofactor do enzima MUT, adenosilcobalamina, revelou resultados dependentes do tipo de mutação. Assim, as três mutações missense (p.His183Leu, p.Arg186Trp e p.Glu193Lys) revelaram uma diminuição da estabilidade proteica, sugerindo uma possível deficiência no mecanismo de folding. As duas mutações in-frame (p.Ile117_Gln118del e p.Arg190dup) revelaram ser responsáveis por uma diminuição drástica dos níveis de proteína. As mutações p.Arg183Leu e p.Arg190dup não se encontravam descritas na literatura e foram detetadas em dois irmãos pertencentes ao grupo cblB que, apesar do mesmo genótipo, apresentam diferenças fenotípicas significativas, sendo um deles assintomático e o outro apresentando níveis ligeiramente elevados de ácido metilmalónico. A sequenciação da região promotora do gene MMAB, bem como uma análise por hibridização genómica comparativa (Metaboloarray®), não revelou nenhuma outra alteração genética. A análise dos níveis da proteína ATR nestes doentes revelou uma redução significativa em comparação com os controlos, bem como diferenças entre os dois irmãos. A análise indireta da atividade da proteína ATR em condições de stress (42°C) revelou uma redução significativa da mesma no irmão assintomático, indicando que as diferenças entre os dois irmãos poderiam estar relacionadas com diferenças na expressão de proteínas envolvidas no sistema de controlo de qualidade proteico. A análise posterior da expressão dos chaperones mitocondriais Hsp60, Hsp70 e da protease Lon, revelou níveis significativamente elevados do chaperone Hsp70 nos dois irmãos em comparação com o controlo e uma redução dos níveis da protease Lon foi observada no caso do irmão assintomático. O conhecimento prévio da existência de disfunção mitocondrial em doentes com acidúria metilmalónica levou à análise da função mitocondrial nos dois irmãos tipo cblB e também em dois doentes pertencentes ao grupo de complementação mut. A análise dos níveis de espécies reativas de oxigénio (ROS), morfologia mitocondrial, função bioenergética e, por último, da formação/abertura do poro mitocondrial, revelou que todos os doentes apresentam uma redução da função mitocondrial quando comparados com os controlos. Observou-se uma correlação positiva entre a disfunção mitocondrial e as diferenças fenotípicas entre os dois irmãos, embora não se tenha detetado uma correlação entre os níveis de ácido metilmalónico e a diminuição da função mitocondrial. Neste trabalho foram também estudadas duas abordagens terapêuticas diferentes, de acordo com o tipo de mutação presente. O uso de um chaperone farmacológico em doentes com acidúria metilmalónica tipo cblB causada por mutações missense, e de terapia antisense em doentes com deficiência no enzima PTPS causadas por mutações de splicing. Estudos in vitro do efeito estabilizador de uma molécula, composto V, em mutantes missense (p.His183Leu, p.Arg186Trp e p.Glu193Lys), previamente caracterizados, revelaram um aumento da estabilidade proteica. O efeito do composto V foi também estudado in vivo sobre a proteína nativa, e observou-se um aumento dos níveis da proteína ATR em órgãos chave desta doença, como o fígado e o cérebro, e sem efeitos tóxicos aparentes. A comparação do efeito estabilizador obtido com o chaperone e o efeito estabilizador obtido com hidroxocobalamina (OHCbl), o cofator atualmente utilizado para tratamento, demonstrou um efeito sinergístico sobre a proteína nativa e o mutante missense, p.Ile96The, inicialmente utilizado para estudar o efeito do composto V. A presença de mutações que afetam o mecanismo de splicing levando à introdução de pseudoexões, tal como se observou em doentes com deficit no enzima PTPS, levou ao uso de terapia antisense para recuperar o mecanismo normal de splicing. As abordagens passaram pela utilização de vários tipos de sondas oligonucleotídicas antisense, tais como antisense morfolino oligonucleotides (AMOs), bem como VIVO-morfolinos e locked antisense oligonucleotides (LNAs), sendo o perfil normal de splicing recuperado com todos os oligonucleótidos utilizados. Para além da recuperação do perfil normal de splicing, foi possível recuperar ainda os níveis normais de proteína e atividade enzimática, bem como a normalização dos diversos compostos intermediários da via metabólica. Os resultados obtidos com este trabalho permitiram, assim, a expansão do espectro mutacional da acidúria metilmalónica isolada, a caracterização funcional de novas proteínas mutantes, bem como a identificação de novas alternativas terapêuticas.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/45753/2008