Prevalencia de mutaciones patogénicas de los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cáncer de mama esporádico. Puesta a punto de un método de cribado basado en el análisis de las curvas de fusión de alta resolución

INTRODUCCIÓN: El cáncer de mama (CM) es la principal causa de morbimortalidad en la mujer con una incidencia mundial de 1.384.155 casos nuevos por año [1]. Aproximadamente, entre el 5-15% de los CM responden al síndrome del cáncer de mama y de ovario hereditario (CMOH) que se debe principalmente a la presencia de mutaciones en los genes BRCA1 (AY273801.1, GI: 30039658) [2] y BRCA2 (AY436640.1 GI: 37675288) [3], (BRCA1/2). La herencia de una única mutación en cualquiera de estos dos genes confiere un riesgo de entre el 45-85% de desarrollar CM a lo largo de la vida [5,6]; sin embargo, la prevalencia real de las mutaciones BRCA1/2 no se conoce al haber sido tan sólo estudiadas en población de alto riesgo. Antoniou et al (2003) [7] estiman en 0,12 la frecuencia alélica de mutaciones en BRCA1/2, sin embargo, en la estimación no se ha considerado el CM esporádico (CME) ni la incidencia de mutaciones en población general. El estudio de mutaciones en los genes BRCA1/2 en el CME ha sido poco abordado. Uno de los primeros estudios realizado por García-Patiño et al [8] en población española, encuentra seis mutaciones patogénicas en una serie de 105 CME (5,7%) al rastrear el gen BRCA1. Se realizaron dos estudios posteriores en población coreana [9,10] en series de 97 y 973 CME, y encontraron tres (3,1%) y quince mutaciones patogénicas (2,5%) respectivamente, en los genes BRCA1/2. Existen otros estudios en este campo, pero presentan las limitaciones de tratarse de series cortas, incluir un único gen o combinar de manera indistinta tanto CME como CMH [11-14]. El escaso conocimiento de la importancia de las mutaciones de los genes BRCA1/2 en el CME demanda la necesidad de realizar estudios en series grandes de CME de población caucásica para determinar la verdadera prevalencia de las mutaciones BRCA1/2 en el CME. El cribado de mutaciones de los genes BRCA1/2 es largo y tedioso debido a su gran tamaño (81 kb y 22 exones BRCA1 y 70 kb y 26 exones BRCA2) ya que se requiere el rastreo completo de los mismos, debido a la inexistencia de zonas calientes donde se concentren las mutaciones y a la aparición frecuente de nuevas mutaciones [2,3]. Aunque no existen zonas calientes en estos genes, se ha observado que su espectro mutacional varía extensamente entre grupos étnicos y/o regiones geográficas [15, 16]. Mutaciones fundadoras para BRCA1/2 han sido descritas en judíos asquenazis, así como en franceses canadienses, suecos, noruegos, finlandeses, holandeses, rusos, japoneses y africanos americanos [17]. El conocimiento del espectro mutacional de la población, así como la identificación de las mutaciones más recurrentes puede servir de ayuda para dirigir los estudios genéticos de BRCA1/2, comenzando por las mutaciones recurrentes más frecuentes. Dado que el 80% de los pacientes con historia familiar resultan negativos para las mutaciones, es de gran utilidad el empleo de procedimientos de cribado que diferencien las muestras con variaciones de la gran mayoría que será normal o wildtype (wt). Los métodos de cribado más extendidos son la “detección de heteroduplex” mediante electroforesis en geles [20], electroforesis capilar [21] o HPLC [22]. Siendo el método de referencia para la confirmación de cualquier variante detectada, la secuenciación directa. El desarrollo de instrumentos de PCR en tiempo real de alta resolución y la incorporación de nuevos intercalantes que permiten saturar la doble cadena del ADN han permitido desarrollar el método de cribado basado en el análisis de las curvas de fusión de alta resolución, High Resolution Melting (HRM) [23]. Este método se fundamenta en la realización, en un único paso y sin manipulación de las muestras, de una PCR a tiempo real seguida de una etapa de formación de heteroduplex y un incremento progresivo de la Tª hasta la total desnaturalización del fragmento amplificado. En este proceso se incluye un intercalante de nueva generación, gracias al cual es posible saturar toda la hebra de ADN sin inhibir la actividad de la Taq polimerasa, y así poder detectar pequeños cambios de fluorescencia en la Tª de desnaturalización (Tª de melting, Tm) del fragmento amplificado permitiendo diferenciar la presencia o ausencia de variaciones moleculares entre las muestras estudiadas [24]. Este método es particularmente sensible para la detección de mutaciones heterozigotas debido a la falta de complementariedad de las hebras del ADN como son las presentes en los genes BRCA1/2. El HRM es un método rápido, sensible y automatizable que elimina los pasos intermedios y la manipulación post-PCR acortando tiempo, contaminación y errores humanos. La sensibilidad, especificidad, bajo coste, rapidez y rendimiento del método lo hacen muy adecuado para el cribado de mutaciones de los genes BRCA1/2 en un elevado número de muestras. Por ello, se propone la puesta a punto de este método para el cribado de las mutaciones españolas en los genes BRCA1/2, que de resultar efectivo reducirá el tiempo de análisis y los costes. OBJETIVOS: 1. Estudio de la prevalencia y espectro de mutaciones de los genes BRCA1/2 en 513 pacientes con CME de la Comunidad Valenciana. 2. Desarrollo de un método de HRM eficaz para el cribado de mutaciones puntuales descritas en la población española en los genes BRCA1/2, y capaz de analizar un elevado número de pacientes en el mismo ensayo. 3. Estudio comparativo entre los resultados obtenidos con el nuevo método de HRM y los obtenidos con el convencional, CSGE, en un grupo de pacientes con CMOH en términos de precisión, sensibilidad, capacidad discriminante, tiempo y coste. Las discrepancias entre los métodos de cribado se solventarán aplicando el método de referencia, la secuenciación de Sanger. 4. Correlación de las características clínico-patológicas de las pacientes con los hallazgos moleculares detectados en los genes BRCA1/2. METODOLOGIA: Pacientes y controles Se han recogido 513 muestras de sangre periférica anticoaguladas con ácido K3-etilendiaminotetracético (EDTA) de pacientes con CME. Se consideraron como CME aquellas pacientes en las que se habían descartado los criterios propios de las familias con cáncer de mama familiar establecidos por el Programa de Consejo Genético de la Comunidad Valenciana [25,26]. De todas las pacientes se han recabado los datos demográficos, las características anatomo-patológicas (TNM, tipo y grado histológico) y los marcadores inmuno-histoquímicos del tumor (RE, RP, HER-2/NEU). Se han reunido 99 controles positivos de ADN portadores de una mutación patogénica diferente, 46 con mutación en BRCA1 y 53 en BRCA2, remitidas al laboratorio desde distintos centros españoles [28-30]. Todas las muestras se han secuenciado, para confirmar la presencia de su mutación patogénica. Extracción de ADN La extracción de ADN se ha realizado a partir de sangre venosa anticoagulada con EDTA empleando el kit comercial UltraClean® Blood DNA Isolation Kit de Tio MolBiol de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El ADN obtenido se ha cuantificado espectrofotométricamente con el NanoDrop ND-1000 para obtener la cantidad y la calidad del mismo. Cribado de mutaciones españolas en BRCA1/2 Para el cribado de mutaciones españolas en los genes BRCA1/2 se han diseñado y sintetizado 49 parejas de cebadores que generan productos de PCR entre 200-300pb, 23 para BRCA1 y 26 para BRCA2. El diseño de los mismos se ha realizado aplicando el software Primer3 [31, 32]. El cribado de mutaciones se ha puesto a punto por HRM, efectuando una PCR en tiempo real en un volumen final de 10 µl empleando High Resolution Melting Master Mix de Roche. La concentración de MgCl2 empleada varía entre 2,5-3,0 mM dependiendo del amplicón. El estudio se ha realizado en la plataforma LightCycler 480 (Roche) utilizando placas de 384 pocillos. En cada ensayo se han incluido además de las muestras de los pacientes con CME, un control wt y un control positivo de la mutación española presente en ese fragmento. Todas las muestras se han procesado por duplicado [33]. El análisis del HRM se ha realizado empleando el Gene Scanning Software Version 1.5.0 (Centro Instrumento Roche, Suiza), que calcula mediante un complejo programa estadístico la diferencia de Tª (Difference plot) entre todos los puntos de la curva de disociación de una de las muestras que toma como referencia o línea base, respecto a cada una de las muestras restantes. De esta manera muestras similares presentan curvas similares, mientras que aquellas que presenten alguna alteración, presentaran una forma diferente a la línea base. Se considera que dos muestras son diferentes cuando el Difference plot es mayor de cinco, o siendo menor de cinco las formas de las curvas son muy distintas. Todas las muestras estudiadas se han agrupado empleando el ajuste de sensibilidad establecido por defecto en el programa (0,3). Secuenciación Todas las mutaciones conocidas y variantes genéticas detectadas han sido confirmadas por secuenciación directa de los productos de PCR generados después del HRM. La electroforesis de los fragmentos se ha realizado en el ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EE.UU). Todas las variantes se han nombrado siguiendo las directrices propuestas por la Human Genome Variation Society (HGVS) [34], donde la A del codón de inicio traslacional ATG es el nucleótido +1. Estadística Se han aplicado los parámetros de análisis descriptivo (parámetros de centralización o de dispersión) para resumir los resultados iniciales. El test Chi-cuadrado de Pearson (X2) se ha utilizado para comprobar la asociación entre variables cualitativas. Usamos el test Z para la comparación de dos proporciones. La regresión logística binaria (Hacia atrás Wald) se ha empleado para probar la asociación de las mutaciones BRCA1/2 con la historia familiar de CM, rasgos patológicos y las características demográficas de los pacientes. Se ha considerado estadísticamente significativo un p valor < 0,05. Todos los análisis estadísticos han sido realizados usando el programa estadístico para ciencias sociales (SPSS) versión 12.0 (Chicago, IL, EE.UU.). CONCLUSIONES: 1. El método de cribado de HRM optimizado permite la detección de las 99 mutaciones españolas estudiadas en los genes de susceptibilidad al cáncer de mama y ovario, BRCA1 y BRCA2. 2. Los resultados del estudio comparativo de los métodos CSGE y HRM realizado en 52 pacientes con CMOH confirman que el método de HRM presenta claras ventajas sobre la CSGE por su mayor sensibilidad, elevado rendimiento, posibilidad de automatización y buena relación coste/beneficio. 3. La baja prevalencia de mutaciones detectada en los genes BRCA1/2 en nuestra serie de pacientes con CME (1,3%) podría deberse al rastreo parcial de estos genes. 4. La presencia de mutaciones en las pacientes con CME se asocia con diagnósticos más tempranos y tumores de fenotipo más agresivo, con mayor TNM, GH más avanzado y mayor proporción de RE negativos. 5. La realización de esta tesis ha permitido la puesta a punto y validación de la técnica de HRM que, combinada con su robotización, ha conferido al método un mayor rendimiento y calidad; permitiendo su implantación en el cribado de mutaciones en los genes BRCA1/2 de todos los pacientes con CMOH incluidos en el PCGCHCV. BIBLIOGRAFIA: [1] Boyley P, Ferlay J. Cancer incidence and mortality in Europe (2004) Ann Oncol; 16:481–488 [2] Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 (1994) Science; 266:66–71 [3] Wooster R, Bignell G, Lancaster J et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 (1995) Nature; 378:789–792 [4] Allan Balmain, Joe Gray & Bruce Ponder. The genetics and genomics of cancer (2003) Nature Genetics; 33:238-244 [5] Ford D, Easton DF, Stratton M et al. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families. 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