Análisis del perfil de metilación CpG del ADN genómico de una población con incongruencia de género

Programa Oficial de Doutoramento en Desenvolvemento Psicolóxico, Aprendizaxe e Saúde. 5034V01[Abstract] Gender incongruence in the ICD-11 (International Classification of Diseases-11) is characterized by “a persistent incongruence between the individual's experience of gender and the sex assigned at birth”. The origin of gender incongruence is complex and multifactorial. Aim: The first part of the research focused on the prospective CpG (cytosine-phosphate-guanine) analysis of the fragment III (RIII) of the estrogen receptor α promoter, in a population with gender incongruence before vs after six months of gender affirming hormone treatment (GAHT). The second part focused on the prospective global CpG methylation using the Illumina© Infinium Human Methylation 850k BeadChip. Material and Methods: The analysis of the CpG profile of the RIII of the estrogen receptor α promoter was carried out using bisulfite genomic sequencing in 20 cis gender and 20 trans gender people before vs after six months of GAHT. DNAs were bisulfited, amplified, cloned, and sequenced. The statistical analysis was carried out with the QUMA (QUantification tool for Methylation Analysis) program. The global CpG analysis was performed on blood from 16 trans gender people before vs after GAHT, in comparison to 16 cis gender people using the Illumina© Infinium Human Methylation 850k BeadChip, after bisulfite conversion. Global methylation profiles were analyzed with the Partek® Genomics Suite® program by a 3-way ANOVA test comparing populations by group, sex and treatment. An enrichment analysis was performed with the Partek® Pathway® program and the WebGestalt. Results: The first part of this study showed (i) that in cis and trans populations, men and women had different RIII methylation patterns; (ii) that before the GAHT, both transgender groups showed a characteristic RIII methylation profile, which did not match any of the cisgender groups; (iii) that GAHT modified the RIII methylation pattern towards more similar methylation profiles to the corresponding gender. The main result of the global methylation study is that the cis and trans populations differ in the degree of methylation before GAHT treatment. In the male population (according to the assignment at birth), 22 CpG islands were found that passed the statistic criteria (FDR p <0.05; fold change ≥ ± 2). The most significant CpGs were related to the genes WDR45, SLC6A20, NHLH1, PLEKHA5, UBALD1, SLC37A1, ARL6IP1, GRASP and NCOA6. Regarding the female population (according to the assignment at birth), 2 CpGs were found that passed the statistical criteria, but none of them were located in islands. One of these CpGs, the one related to the MPPED2 gene, is shared by both trans men and trans women. Enrichment analysis showed that these genes are involved in important functions such as negative regulation of gene expression (GO: 0010629), development of the central nervous system (GO: 0007417), brain development (GO: 0007420), ribonucleotide binding (GO: 0032553) and RNA binding (GO: 0003723). Furthermore, six months of GAHT treatment modified the methyloma in both trans populations. The before vs after methylome study revealed a significant decrease in methylation in both trans populations. Trans men showed variations in 95 CpG islands, of which 72.63% decreased the degree of methylation after treatment. Regarding trans women, six months of GAHT modified the methylation in 78 CpGs islands, of which 85.9% were hypomethylated after treatment. Thus, in both trans populations, GAHT induced a significant reduction in methylation.[Resumen] La incongruencia de género en el CIE-11 (Clasificación Internacional de Enfermedades-11) se caracteriza por “una incongruencia persistente entre la experiencia individual de género y el sexo asignado al nacer”. Su origen es complejo y multifactorial. Objetivo: La primera parte de la investigación se centró en el análisis retrospectivo CpG (citosina-fosfato-guanina) del fragmento III (RIII) de la región promotora del receptor de estrógenos α, en una población de hombres y mujeres con incongruencia de género, antes vs después de seis meses de tratamiento hormonal de afirmación de género (GAHT). La segunda parte de la investigación se centró en el análisis de la metilación global CpG utilizando el BeadChip de metilación de 850k de Illumina© Infinium. Material y métodos: El análisis del perfil de metilación del RIII se realizó mediante secuenciación por bisulfito en 20 personas cis género y 20 personas trans género antes vs después del GAHT. Los ADNs se trataron con bisulfito, se amplificaron, clonaron y secuenciaron. El análisis estadístico se realizó con el programa QUMA (QUantification tool for Methylation Analysis). El análisis global de metilación se realizó en 16 personas cis género y 16 personas trans género con el BeadChip de metilación de 850K de Illumina© Infinium, después de la conversión con bisulfito. Los perfiles de metilación se analizaron con el programa Partek® Genomics Suite® mediante un ANOVA de 3 vías comparando las poblaciones según grupo, sexo y tratamiento. Finalmente se realizó un análisis de enriquecimiento con el programa Partek® Pathway y la WebGestalt. Resultados: La primera parte del estudio mostró (i) que en ambas poblaciones, cis y trans, los hombres y las mujeres presentan patrones de metilación diferentes del RIII; (ii) que antes del tratamiento GAHT, ambos grupos trans (hombres y mujeres) presentaban perfiles de metilación intermedios, no coincidentes con las poblaciones cis; (iii) que el GAHT modificó el patrón de metilación del RIII hacia perfiles más similares al género correspondiente. En cuanto al estudio de metilación global, el principal resultado es que las poblaciones cis y trans difieren en el grado de metilación antes del tratamiento GAHT. En la población masculina (según el sexo natal asignado), se encontraron 22 islas CpGs que pasaron los criterios estadísticos (FDR p <0.05; fold change o incremento del cambio ≥ ± 2). Los CpGs más significativos se relacionaron con los genes WDR45, SLC6A20, NHLH1, PLEKHA5, UBALD1, SLC37A1, ARL6IP1, GRASP y NCOA6. En cuanto a la población femenina (según el sexo natal asignado), se encontraron 2 CpGs que pasaron los criterios estadísticos, pero ninguno de ellos se ubicaba en islas. Uno de estos CpGs, el relacionado con el gen MPPED2, es compartido por hombres y mujeres trans. El análisis de enriquecimiento mostró que estos genes están involucrados en funciones importantes como la regulación negativa de la expresión génica (GO: 0010629), el desarrollo del sistema nervioso central (GO: 0007417), el desarrollo del cerebro (GO: 0007420), la unión de ribonucleótidos (GO: 0032553) y la unión de ARN (GO: 0003723). Además, seis meses de tratamiento GAHT produjo una disminución significativa en la metilación en ambas poblaciones trans. Los hombres trans mostraron variaciones en 95 islas CpG, de las cuales el 72,63% disminuyó el grado de metilación después del tratamiento. En cuanto a las mujeres trans, seis meses de GAHT modificaron la metilación en 78 islas CpG, de las cuales el 85,9% estaban hipometiladas tras el tratamiento. Por tanto, en ambas poblaciones trans, el tratamiento GAHT indujo una reducción significativa de la metilación.[Resumo] A incongruencia de xénero no CIE-11 (Clasificación Internacional de Enfermidades-11) caracterízase por “unha incongruencia persistente entre a experiencia individual de xénero e o sexo asignado ao nacer”. A súa orixe é complexa e multifactorial. Obxectivo: A primeira parte da investigación centrouse na análise retrospectiva da metilación CpG (citosina-fosfato-guanina) do fragmento III (RIII) da rexión promotora do receptor de estróxenos α, nunha poboación de homes e mulleres con incongruencia de xénero, antes vs despois de seis meses de tratamento hormonal de afirmación de xénero (GAHT). A segunda parte da investigación centrouse na análise da metilación global utilizando o BeadChip de metilación de 850K de Illumina© Infinium, antes vs despois de seis meses de GAHT. Material e métodos: A análise do perfil de metilación do RIII realizouse mediante secuenciación por bisulfito en 20 persoas cis xénero e 20 persoas trans xénero. Os ADNs tratáronse con bisulfito, se amplificaron, clonaron e secuenciaron. A análise estatística realizouse co programa QUMA (QUantification tool for Methylation Analysis). A análise global de metilación realizouse en 16 persoas cis xénero e 16 trans xénero antes vs despois de seis meses de GAHT co BeadChip de metilación de 850K de Illumina© Infinium, despois da conversión con bisulfito. Os perfís de metilación analizáronse co programa Partek® Genomics Suite® mediante un ANOVA de 3 vías, comparando as poboacións por grupo, sexo e tratamento. Finalmente realizouse unha análise de enriquecemento co programa Partek® Pathway e a WebGestalt. Resultados: A primeira parte do estudo mostrou (i) que en ambas poboacións (cis e trans), os homes e as mulleres tiñan patróns de metilación do RIII diferentes; (ii) que antes do tratamento GAHT, ambos grupos trans (homes e mulleres) presentaban perfís de metilación intermedios, non coincidentes coas poboacións cis; (iii) que o GAHT modificou o patrón de metilación do RIII cara a perfís máis similares ao xénero correspondente. En canto ao estudo global de metilación, o principal resultado é que as poboacións cis e trans difiren no grao de metilación global antes do tratamento GAHT. Na poboación masculina (segundo a asignación ao nacer), atopáronse 22 illas CpGs que superaron ambos criterios estatísticos (FDR p