nArgBP2의 액상 간 상분리 현상을 통한 구조적 가소성 조절 기전에 관한 연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의과학과, 2023. 8. 장성호.Ablation of nArgBP2, a candidate gene of intellectual disability (ID), caused defects in spine maturation and excitatory synapse formation in developing neurons. Interestingly, I found that the KD of nArgBP2 in mature neurons did not lead to any observable morphological abnormalities in the preexisting spines during resting conditions, thereby prompting further inquiries into its functional role in mature neurons. However, I found that nArgBP2 KD completely abolished the enlargement of dendritic spines during chemically induced long-term potentiation (cLTP) in mature neurons. I found that nArgBP2 forms biomolecular condensates in dendritic spines by phase separation and that these condensates are dispersed by cLTP. Liquid-liquid phase separation refers to the phenomenon where biomolecules, such as proteins and nucleic acids, undergo phase separation and form liquid-like droplets within cells. This process has emerged as a critical mechanism for regulating various biological processes, including cellular organization, signal transduction, and gene expression. nArgBP2 undergoes liquid-liquid phase separation through multivalent intermolecular interactions mediated by SH3 domains and proline-rich domains. Furthermore, nArgBP2 forms coacervates with CaMKIIα, which undergoes rapid disassembly upon calcium/CaMKIIα-dependent phosphorylation. I further showed that the interaction between nArgBP2 and WAVE1 counteracts condensate formation. Together, these findings strongly suggest that in the resting state, nArgBP2 is sequestered within condensates, but it is released due to CaMKIIα-mediated phosphorylation during synaptic plasticity. Subsequently, the released nArgBP2 can engage in a timely interaction with WAVE1, thereby inducing spine head enlargement in mature neurons. Also, there is a zinc finger motif in the NSE (Neural Specific Exon) domain of nArgBP2 and the role of the NSE domain has not been studied. I found that nArgBP2 mutant without NSE shows different localization of nArgBP2. Also, treatment with a high concentration of zinc ion makes nArgBP2 less prominent at dendritic spines. In addition to revealing the underlying mechanism of nArgBP2 functionality in mature neurons with zinc, these results also suggest its defect may contribute to the pathogenesis of neurological disorders.수상돌기가시는 뇌에서 대부분의 흥분성 시냅스 신호를 받는 수상돌기의 구조이며 주로 액틴 필라멘트로 이루어져 있다. 수상돌기가시의 형태는 매우 다양하며 수많은 액틴 조절 단백질들에 의해 역동적으로 조절된다. nArgBP2는 흥분성 시냅스의 형성과 기능에 중요한 단백질로 알려져 있으며 nArgBP2의 유전적 결실은 인간의 지적장애와 유사한 행동을 쥐에서 유발한다는 연구결과도 있다. 이전의 연구결과에서는 발단 단계의 신경세포에서는 RNA 간섭에 의한 nArgBP2 발현 저해가 수상돌기가시 형성에 영향을 주어 정상적인 형태의 수상돌기가시가 아닌 필로포디아의 형성을 증가시켰다. 하지만 이미 수상돌기가시 형성이 완료된 후 신경세포에서 nArgBP2 발현 저해에서는 수상돌기가시의 형태에 아무런 영향을 끼치지 않았다. 발달단계의 신경세포와 같이 구조적 리모델링이 일어날 때 nArgBP2가 역할을 할 것이라고 추론하였고, 이를 확인하기 위해 성숙한 신경세포에서 구조적 리모델링을 일으킬 수 있는 화학적 장기강화 (cLTP: chemical long-term potentiation)을 유도해보았다. 화학적 장기강화를 일으켰을 때 컨트롤 세포의 수상돌기가시는 그 크기가 커지는 반면 nArgBP2 발현이 저해된 신경세포에서는 크기가 변하지 않거나 작아지는 현상을 보였다. 이는 같은 조건에서 초고해상도 이미징을 통해 3차원 구조의 형태학적 측정값을 확인한 결과, 성숙한 신경세포에서는 nArgBP2의 결핍이 수상돌기가시의 머리 크기 확대를 저해함을 알 수 있었다. 성숙한 신경세포에서 화학적 장기강화가 유도되었을 때 nArgBP2의 형태를 라이브 이미징으로 관찰하고자 nArgBP2 발현 저해와 동시에 shRNA 저항 nArgBP2를 발현시켜 관찰하였다. 그 결과 대부분의 nArgBP2가 수상돌기가시에 응집체 형태로 존재하고, 화학적 장기강화가 유도되면 그 응집체가 분산되는 현상을 보였다. 또한, 응집체가 분산되면서 수상돌기가시의 머리 크기가 커지는 것이 관찰되었다. 이러한 현상은 nArgBP2의 SH3 도메인만 존재할 때도 확인할 수 있었다. nArgBP2의 SH3 도메인에 칼슘/칼모듈린 인산화 부위로 추정되는 부분이 존재하며, 이 잔기들이 모두 보존되는 것을 보아 화학적 장기강화 동안 칼슘/칼모듈린 인산화에 의해 nArgBP2가 영향을 받을 것이라고 추론하였다. 이를 확인하고자 인산화 결핍 돌연변이를 만들어 동일하게 신경세포에서 라이브 이미징한 결과, 응집체가 분산되지 않으며 수상돌기가시의 머리 크기 또한 커지지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 화학적 장기강화 동안 nArgBP2 응집체의 확산 및 수상돌기 가시의 머리 크기 확대에는 칼슘/칼모듈린에 의한 인산화가 필요함을 나타낸다. 화학적 장기 강화 동안 nArgBP2 응집체의 확산을 보아 응집체가 고체와 같은 집합체가 아니라 액체-액체 상 분리에 의해 발생하는 액체와 같은 응집체와 유사하다고 추론하였고, 이를 확인하고자 액상 간 상 분리에 의한 응집체를 확산시킨다고 알려진 헥산다이올을 처리해서 응집체가 확산하는 것을 확인하였다. 또한, 신경세포뿐만 아니라 COS7 세포에서도 SH3 도메인으로 액상 간 상 분리를 통해 응집체를 이루고, 정제된 단백질에서도 액상 간 상 분리에 의한 응집체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 앞서 신경세포에서 확인하였던 것처럼 COS7 세포에서 칼슘/칼모듈린에 의한 nArgBP2 응집체 확산을 관찰하였다 화학적 장기강화가 일어나는 동안 nArgBP2로 인한 수상돌기가시 확대는 WAVE1 상호 작용에 의해 조절된다. WAVE1은 Arp2/3 복합체를 통해 신호를 전달하여 액틴 중합을 조절하여 수상돌기가시를 확대하는 것으로 알려져 있으며, 우리는 이전에 nArgBP2가 WAVE을 통해 수상돌기가시 형태를 조절한다는 것을 밝혀내었다. 따라서 WAVE1과 nArgBP2 사이의 상호 작용이 화학적 장기강화 동안 수상돌기가시 확대에 필요하다는 추론을 하였다. 이 가설을 확인하고자 화학적 장기강화 자극 동안 WAVE1과 nArgBP2 간의 상호 작용을 차단하기 위해 nArgBP2에 미토콘드리아 표적 태그를 달아 세포질에서 미토콘드리아로 격리하였다. 그 결과 nArgBP2가 화학적 장기강화 동안 응축물에서 분산될 것으로 예상하지만 확산된 ArgBP2는 미토콘드리아로 격리되기 때문에 WAVE1과 상호작용할 수 없고 그로 인해 수상돌기가시가 커지지 않는 것을 확인하였다. 최근 시냅스 전후에는 액상 간 상 분리 어셈블리가 포함될 수 있다는 연구결과가 보고되었으며, 이는 뉴런 시냅스 내 및 사이의 신호 전달을 조율하는 데 중요하다고 밝혀지고 있다. SynGAP 및 FMRP(Fragile X Mental Retardation Protein)는 액상 간 상 분리를 일으키는 것으로 밝혀졌고, PSD95, GKAP 등 시냅스 후 단백질도 액상 간 상 분리를 통해 응축된 어셈블리를 생성한다는 연구결과도 있다. nArgBP2가 다른 시냅스 후 단백질과 응축물을 형성하는지와 nArgBP2 응축물의 형성이 다른 시냅스 단백질에 의해 영향을 받는지 향후 연구를 통해 밝혀낼 수 있을 것이다. 이러한 단백질의 활성에 대한 액상 간 상 분리 조절은 증상이 겹치는 여러 신경 정신 장애의 기본 메커니즘을 이해하기 위한 새로운 기회를 제공할 수도 있을 것이다. 또한, nArgBP2에는 NSE라는 특이적인 도메인이 존재하며 도메인 내에는 zinc finger 모티프가 있다고 알려져 있다. 하지만 이러한 NSE의 역할은 아직 밝혀진 바가 없다. NSE의 역할을 알고자 NSE 도메인이 존재하지 않는 돌연변이를 발현시킨 결과, nArgBP2가 수상돌기가시에 덜 존재하는 것으로 보아 NSE 도메인이 nArgBP2의 정상적인 위치 발현에 중요함을 알 수 있었다. 또한 높은 농도의 아연을 처리했을 때에도 마찬가지로 nArgBP2의 발현위치가 달라지는 것을 확인하였다. 이를 통해 정상적인 뇌 기능에 중요하다고 알려진 아연과의 결합과 또 다른 시냅스 단백질과의 연관성에 대한 추가 연구가 필요함을 알 수 있었다. 본 내용은 Exp Mol Med 에 출판 완료된 내용임.Abstract 1 Contents 3 List of Figures and Tables 4 List of Abbreviations 6 Introduction 7 Material and Methods 11 Results 19 Discussion 59 Reference 67 Abstract in Korean 75박