Studies on the Neuroprotective Role of Vaccinia- Related Kinase 3 in Oxidative Stress and Glutamate-Induced Excitotoxicity Conditions

DoctorAlthough extracellular signal-related kinase (ERK1/2) activity is generally associated with cell survival, unusually sustained ERK activation causes its nuclear translocation and contributes to neuronal cell death via transcriptional regulation of proapoptotic proteins. Excitotoxicity caused by excessive activation of glutamate receptors, impairment of intracellular calcium homeostasis, increased reactive oxygen species, persistent ERK activation, and protein aggregation are implicated in neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD) and Parkinson’s disease (PD). However, the endogenous protective mechanisms against neurodegeneration are poorly understood. In this thesis, I identified vaccinia-related kinase 3 (VRK3)-mediated protective mechanisms against persistent ERK activation-induced neuronal cell death. First, I found that hydrogen peroxide (H2O2)-induced activation of cyclin-dependent kinase 5 (CDK5), a highly conserved proline-directed Ser/Thr kinase that is predominantly activated in the neurons, stimulates neuroprotective signaling via phosphorylation of VRK3 at Ser 108. CDK5-mediated phosphorylation of VRK3 enhances vaccinia H1-related phosphatase (VHR) activity by facilitating the recruitment of phospho-ERK to VHR and suppresses oxidative stress-induced prolonged ERK activation that causes cell death in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. However the CDK5 was unable to phosphorylate mutant VRK3, and thus the mutant forms of VRK3 could not attenuate apoptotic process. Suppression of CDK5 activity results in increase of ERK activation and elevation of proapoptotic protein Bak expression in mouse cortical neurons. Results from VRK3-deficient neurons were further confirmed the role of VRK3 phosphorylation in H2O2-evoked ERK regulation. Importantly, I showed an association between phospho-VRK3 levels and the progression of human AD and PD. Second, I found that VRK3-mediated nuclear localization of heat shock protein 70 (HSP70) induced by glutamate treatment leads to enhancement of VHR phosphatase activity via protein-protein interaction rather than its molecular chaperone activity, thereby suppressing excessive ERK activation. Overexpression of HSP70 fused to a nuclear localization signal attenuated apoptosis more than HSP70 alone. The importance of nuclear localization of HSP70 in the negative regulation of glutamate-induced ERK activation was further confirmed in VRK3-deficient neurons. Importantly, I showed a positive correlation between levels of VRK3 and HSP70 in the progression of AD and PD in humans, and neurons with HSP70 nuclear localization exhibited less Aβ accumulation in brains from patients with AD. In conclusion, oxidative stress- and glutamate excitotoxicity-mediated persistent ERK activation has been considered as one of causes to develop neurodegenerative diseases. I demonstrated that CDK5-mediated VRK3 phosphorylation and VRK3-mediated HSP70 nuclear localization are required for a negative feedback circuit that suppresses persistent ERK activation via enhancement of VHR phosphatase activity. VRK3 acts as a molecular link between the CDK5 and MAPK signaling as well as HSP70 and MAPK signaling. I believe that this study has strong implications for the protective role of nuclear CDK5 and HSP70 which is uncovered in the regulation of nuclear ERK in neurodegenerative diseases. Moreover, nuclear HSP70 suppresses protein aggregation. Therefore, the level and phosphorylation of VRK3 as well as the nuclear localization of HSP70 could potentially serve as diagnostic and therapeutic targets in neurodegenerative diseases.오늘날 의학기술의 발달과 생활수준의 향상, 여성의 사회 진출 확대 등에 기인한 결과로 평균 수명이 연장되고 출산율은 낮아지면서 전 세계적으로 인구 구조가 고령화되고 있다. 고령화 사회의 진행과 함께 치매, 뇌혈관질환, 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 뇌질환이 점차 증가하는 추세이며, 이로 인한 사회•경제적 비용도 매년 가중되고 있다. 여러 연구를 통해 퇴행성 뇌신경계 질환들이 산화적 스트레스, 흥분독성과 같은 몇 가지 특성을 공유한다는 사실이 밝혀졌으나, 뇌신경세포의 사멸을 억제하는 효과적인 수단은 아직 뚜렷한 것이 없고 이에 대한 연구는 지속적으로 이루어지고 있다. 산화적 스트레스는 활성산소종의 생성과 항산화 방어 기작의 불균형에 의해 발생하여 DNA, 지방, 단백질, 미토콘드리아 등 다양한 거대분자에 산화적 손상을 입힘으로써, 또한 글루타메이트 수용체의 과도한 활성화에 의해 유도되는 흥분독성은 세포 내 칼슘 항상성을 깨뜨리고 활성산소종의 생성을 증가시키며 인산화 효소나 단백질 분해효소의 활성을 변화시킴으로써, 신경세포를 사멸로 이끈다. 산화적 스트레스와 글루타메이트 수용체의 지나친 활성화에 의한 흥분독성은 공통적으로 ERK 1/2의 과도한 활성화를 유도한다. 일반적으로 ERK는 세포질과 핵 안에 있는 다양한 기질들을 인산화 시킴으로써 세포의 증식과 분화, 이동, 개체의 발생 등 다양한 생리현상에 관여한다고 알려져 있으나, 지속적인 ERK의 활성은 핵 내 이동과 세포사멸 촉진 단백질의 전사적 조절을 통해 신경세포죽음에 기여한다는 사실이 최근 들어 밝혀지고 있다. ERK의 활성기전에 대해서는 많은 연구가 진행되어 ‘수용체 – Ras – Raf – MEK – ERK’ 로의 순차적 인산화를 통한 세포 내 신호전달 기전이 확립되었으나, 비활성화 기전에 대해서는 최근에 들어서야 연구가 이루어지고 있다. 선행연구에서 VRK3가 결합에 의해 ERK를 기질로 하는 탈인산화 효소인 VHR의 활성을 증가시킴으로써, 핵 내 ERK 단백질의 활성을 음성적으로 조절한다는 것을 밝힌 바 있다. 본 연구에서는 산화적 스트레스나 글루타메이트 수용체의 과활성화에 의해 유도되는 ERK의 지나친 활성 유지를 억제함으로써 세포사멸로부터 신경세포를 보호하는 역할을 하는 인자를 밝히고자 하였고, 더 나아가 이들 인자들 간의 상호작용에 대해 연구하고자 하였다. 첫째로 과산화수소 처리에 의해 유도되는 산화적 스트레스 상황에서 액틴 다이나믹스, 미세소관의 안정성과 이동, 시냅스의 구조와 가소성, 축삭 유도 등 중추신경계에서의 중요한 역할이 많이 알려져 있는 CDK5라는 인산화 효소가 VRK3를 인산화 시킴을 발견하였다. Scaffold인 VRK3의 인산화는, VHR과의 결합친화성에는 영향을 주지 않지만 그 기질인 인산화된 ERK 1/2와의 결합친화력은 증가시켜 결과적으로 VHR에 의한 ERK 1/2의 탈인산화 작용을 용이하게 함을 확인하였다. 산화적 스트레스 상황에서 CDK5에 의한 VRK3의 인산화는 핵 내 과도한 ERK 1/2의 활성을 억제함으로써 세포사멸로부터 신경세포를 보호하는 역할을 한다는 사실을 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y와 배양된 쥐 대뇌피질 신경세포에서 규명하였다. 더 나아가 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병 환자의 뇌에서 VRK3의 인산화 정도가 증가되어 있다는 것을 관찰함으로써 VRK3가 실질적으로 산화적 스트레스에 의해 유도되는 과도한 ERK 1/2의 활성을 억제하여 신경보호의 역할을 수행할 수 있음을 밝혔다. 이 연구 결과를 바탕으로 두 번째로 CDK5 이외에 어떤 인자가 과도한 ERK 1/2의 활성을 조절하는지, 그리고 이들 인자들이 어떤 작용 기전을 가지는지 알아보았다. 그 결과, 분자적 샤페론으로서 변성된 단백질의 분해와 이동, 변성된 단백질 집합체의 해리, 타겟 단백질의 구조 안정화를 통한 응집의 억제 등에 역할하는 HSP70가, 샤페론 활성에 상관없이 결합만으로 ERK 1/2의 탈인산화 효소인 VHR의 활성을 증가시킨다는 사실을 발견하였다. 또한 고농도의 글루타메이트 처리로 흥분독성이 유도된 상황에서 VRK3가 결합을 통해 HSP70의 핵 내 위치를 돕는다는 사실을 밝혔다. ERK 1/2 활성의 음성적 조절자로서 HSP70의 역할과 VRK3에 의한 핵 내 위치의 중요성을 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y 외에 배양된 쥐 대뇌피질 신경세포에서도 규명하였다. 더 나아가 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병 환자의 뇌에서 HSP70와 VRK3의 양이 증가되어 있고 신기하게도 알츠하이머씨병 환자의 뇌에서 HSP70가 핵 내 위치하는 뉴런은 적은 아밀로이드-베타 축적을 나타냄을 관찰하였다. 즉, VRK3에 의한 HSP70의 핵 내 위치가 VHR과의 결합을 통해 ERK 1/2의 활성을 감소시키고 퇴행성 뇌질환의 또 다른 공통된 특성인 단백질 응집을 저해하여 세포사멸로부터 신경세포를 보호한다는 사실을 밝혔다. 현재 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있는 핵심 기전에 기반한 치료기술은 전무한 상태로, 핵심 기전 기반 신 치료기술의 개발은 고령화 사회를 준비하는 현 시점에서 전 세계적으로 중요한 과제이다. 본 연구는 산화적 스트레스 또는 글루타메이트 흥분독성에 의해 신경세포 사멸이 유도될 때 CDK5, VRK3, HSP70가 VHR의 활성을 직접 또는 간접적으로 증가시켜 ERK 1/2의 과한 활성이 유지되는 것을 막아 결과적으로 세포사멸로부터 신경을 보호한다는 새로운 분자적 작용기작을 밝힘으로써, 과거보다 이해의 폭을 넓혔으며 신경퇴화 진행을 억제하는 신약의 개발에도 기여할 수 있을 것이다