Positional cloning of the parthenocarpic fruit (pat) mutant gene and identification of new parthenocarpic sources in tomato (Solanum lycopersicum, L.)

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliIn this work we characterized two parthenocarpic sources in tomato by positionally cloning the gene responsible of the parthenocarpic fruit (pat) phenotype and by TILLING the SlIAA9 gene, a major member of the ovary repressor machinery before pollination. The importance of parthenocarpic mutations is due to their possible use in breeding programs, as well as in studies aimed to the comprehension of mechanisms underlying the fruit set. An understanding of the molecular events underlying parthenocarpy, in fact, would provide information on factors regulating fruit and seed formation, and thus open new perspectives for yield improvements by biotechnological means. The pat mutation (Bianchi and Soressi, 1969), induces parthenocarpy with strong expressivity along with other pleiotropic effects such as short anthers and aberrant ovules (Mazzucato et al., 1998). Through Bulk Segregant Analysis the Pat gene was mapped, by using two segregating populations, on the long arm of chromosome 3 between two conserved ortholog set (COS) markers (COSes; Fulton et al., 2002), T0796 and T1143 (Beraldi et al., 2004), previously anchored on the genetic tomato map (EXPEN 2000, www.sgn.cornell.edu). We developed and mapped novel PCR-derived COS markers inside the target window for the Pat gene by pursuing the microsynteny between tomato and Arabidopsis (Fulton et al., 2002). Through genetic and physical mapping, the genetic region spanning 1.2 cM between COSes T0796 and T1143, was refined with new anchor-points and the target interval for the Pat locus was restricted to less than 0.2 cM between markers named T17 and T20. The small size of the new target region and the recent publication of the tomato genome sequence (SGN, www.sgn.cornell.edu) allowed us to carry out a candidate gene approach with the aim to clone the gene responsible for the pat phenotype. Four of the nine potential candidate genes mapping in the T17-T20 genomic window, were amplified and sequenced from WT (Chico III) and pat lines. A point mutation in the SlHB15 gene, a transcriptor factor belonging to the HD-Zip III family, was found and proposed as responsible for the pat phenotype. In order to confirm this hypothesis a complementation experiment with the HB15 WT gene will be necessary. HD-Zip III and KANADI, two antagonistic gene families, were included in a new model that would explain the pat phenotype and the molecular pathway that triggers the fruit set. Abstract 2 In the second part of this work, a TILLING approach has been undertaken in order to identify tomato genotypes carrying mutations in the SlIAA9 coding sequence. As demonstrated in recent publications, TILLING shows promise as a non-transgenic tool to improve domesticated crops by introducing and identifying novel genetic variation in genes that affect key traits. SlIAA9, a member of the Aux/IAA family of transcription factors in tomato, has been described as playing a major role in the ovary repressor machinery and plants silenced by antisense showed several IAA-related developmental defects and a parthenocarpic behavior (Wang et al., 2005). The analysis of M3 families yielded three lines carrying a genetic lesion in the coding sequence of SlIAA9, two showing a point mutation leading to amino acidic substitution and the third showing a single-base deletion leading to a frame-shift and a premature stop codon. Characterization of the former lines, showed some of the expected phenotypes, albeit with low penetrance and expressivity (occurrence of polycots, abnormal growth of axillary shoots, low number of seeds per fruit or seedlessness). Characterization of the latter line showed severe phenotypes, in agreement with those expected, that mainly consisted in an obvious loss of leaf compoundness and parthenocarpy. This observation suggest the interest of this line in studying the role of the IAA9 transcription factor in reproductive development, although its partial sterility may hamper its employment in breeding parthenocarpic tomato varieties.In questo lavoro sono state caratterizzate due fonti di partenocarpia in pomodoro attraverso il clonaggio per mappatura del gene responsabile del fenotipo del mutante partenocarpic fruit-1 (pat) e attraverso il TILLING del gene SlIAA9, uno dei principali membri del sistema di repressione dell’ovario prima dell’impollinazione. L’importanza delle mutazioni di partenocarpia è dovuta al loro possibile ruolo nei programmi di breeding ma anche in studi il cui scopo è quello di comprendere i meccanismi molecolari che portano alla formazione del frutto. Infatti, la comprensione dei meccanismi molecolari che inducono la partenocarpia fornirebbe informazioni anche sui fattori che regolano la formazione del seme e del frutto, e così aprirebbe nuove prospettive per il miglioramento genetico attraverso mezzi biotecnologici. La mutazione pat (Bianchi and Soressi, 1969) induce partenocarpia con forte espressività ma causa anche altri effetti pleiotropici quali la formazione di antere corte e Abstract 3 ovuli aberranti (Mazzucato et al., 1998). Attraverso l’analisi dei gruppi segreganti (BSA) il locus Pat è stato precedentemente mappato sul braccio lungo del cromosoma 3 di pomodoro tra due marcatori ortologhi conservati (COS; Fulton et al., 2002), T0796 e T1143 (Beraldi et al., 2004), ancorati sulla mappa genetica pubblicata all’SGN (Sol Geomics Network; EXPEN 2000, www.sgn.cornell.edu). In questo studio, tramite l’utilizzo della microsintenia tra Arabidopsis e pomodoro (Fulton et al., 2002), sono stati sviluppati e mappati all’interno della regione target per il gene Pat nuovi marcatori COS PCR-derivati. Attraverso un lavoro di mappatura genetica e fisica, la regione genetica di 1,2 cM, tra i marcatori T0796 e T1143, è stata rifinita con nuovi marcatori e la regione target per il locus Pat è stata ristretta a circa 0,2 cM, tra due marcatori denominati T17 e T20. Le ridotte dimensioni della nuova regione e la recente pubblicazione del genoma di pomodoro (SGN; www.sgn.cornell.edu) hanno quindi permesso di attuare l’analisi di potenziali geni candidati al fine di isolare quello responsabile del fenotipo pat. Quattro di nove geni, localizzati nella regione genomica tra i marcatori T17 e T20, sono stati sequenziati nella linea pat e nel corrispettivo WT (Chico III). In questo modo, una mutazione puntiforme sul gene SlHB15, un fattore di trascrizione appartenente alla famiglia genica HD-Zip III, è stata identificata e proposta come responsabile del fenotipo pat. Al fine di confermare questa ipotesi, sarà necessario un esperimento di complementazione con il gene HB15 WT sulla linea pat. Due famiglie geniche antagoniste, HD-Zip III e KANADI, sono state incluse in un nuovo modello che spiegherebbe il fenotipo pat e il pathway molecolare che porta alla allegagione del frutto. Nella seconda parte di questo lavoro, al fine di identificare nuove fonti di partenocarpia in pomodoro, il gene SlIAA9 è stato saggiato su due popolazioni di TILLING (cultivar Red Setter; Minoia et al., 2010) disponibili presso l’ Istituto di Ricerca Metapontum Agrobios. Infatti, come recentemente dimostrato in diverse pubblicazioni, il TILLING può rappresentare una metodologia che non ricorre al transgenico per migliorare le specie di interesse agrario attraverso l’induzione e l’identificazione di nuove forme alleliche in geni che controllano tratti chiave per il miglioramento genetico. Il gene SlIAA9, un membro della famiglia di fattori di trascrizione Aux/IAA in pomodoro, è uno dei componenti chiave del complesso molecolare responsabile della repressione dell’ovario prima dell’impollinazione; il silenziamento di questo gene provoca difetti di sviluppo correlati all’ IAA e la formazione di frutti partenocarpici (Wang et al., 2005). L’analisi di circa 5000 famiglie M3 ha portato all’identificazione di tre linee con una lesione sulla sequenza codificante il gene SlIAA9: due di esse mostrano una mutazione puntiforme che causa una sostituzione Abstract 4 amminoacidica, la terza mostra una delezione di una base che causa un errore di lettura ed un prematuro codon di stop. La caratterizzazione delle prime due linee ha mostrato alcuni dei tratti fenotipici attesi, anche se con bassa penetranza ed espressività (formazione di più cotiledoni, crescita anormale di germogli ascellari, basso numero o assenza di semi nel frutto). La caratterizzazione della terza linea ha mostrato caratteri fenotipici più forti, in accordo con quelli attesi, che consistono soprattutto in una perdita di complessità delle foglie e partenocarpia. Queste osservazioni mettono in risalto l’interesse di questa linea nello studio del ruolo che il fattore di trascrizione IAA9 ha nello sviluppo riproduttivo; la sua maggiore caratterizzazione relativa alla capacità di produrre frutti e semi ne indicherà le prospettive reali di utilizzo nel miglioramento genetico di pomodoro