Caratterizzazione di diversi mutanti sterili condizionali in pomodoro, i quali ostativamente coinvolgono i fattori di trascrizione Mads-box di classe B

Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliMale sterility is defined as the inability of plants to produce or release functional pollen grains. Genic male sterility (GMS) was studied in detail in the past and used for hybrid seed production in several plant species. The hybrid production obtained using GMS is characterized by several problems that are associated with this type of male sterility. The main problem that occurs is the maintenance of the male sterile line, which involves a backcross with heterozygous maintainer plants, but the progeny will be 50% sterile and 50% fertile and selection is needed to obtain a purely male sterile seed parent. To bypass this limit, it could be helpful to use environmental-sensitive genic male sterility (EGMS) mutations, where the sterility and fertility restoration are influenced by environmental factors such as temperature and photoperiod. The EGMS was reported in many plant species and it represents a very powerful system in hybrid seed production, especially in rice. In tomato, different male sterile mutants have been described where the sterility/fertility condition is influenced by the action of temperature or photoperiod, in particular vms, pi-2, sl, TAP3 and sl-2 for the temperature and 7B-1 for the photoperiod. This thesis aimed to the morphological and molecular characterization of EGMS genotypes in tomato. Literature data and examination of the phenotype indicated as candidates for these mutations members of the class B MADS-box transcription factors family, that specify petal and stamen organ identity. In Arabidopsis thaliana and Antirrhinum majus, there are two class B genes that, referring to the A. majus nomenclature, are known as DEFICIENS (DEF) and GLOBOSA (GLO). In tomato, as in most solanaceae, four class B MADS-box genes are found, two DEF-like members (SlDEF and SlTM6) and two GLO-like members (SlGLO1 and SlGLO2). The main objective of the research was the phenotypic characterization of the 7B-1 mutant and the identification of the putative gene underlying the mutation. The other goals of this work were represented by studies conducted in order to characterize other tomato male sterility mutations, such as sl-2, pi-2, TAP3 and vms in environmental conditions that favor or not the expression of the sterile phenotype. The tomato 7B-1 mutant has a strong potential for production of tomato hybrid seeds, being male sterile in long days, while in short days it produces several male fertile flowers. The morphological characterization of the mutant was performed under environmental conditions that favor the sterility expression and in those that determine a partial fertility restoration. Given the phenotypic similarity between 7B-1 and sl-2, it was taken into consideration the possibility to grow this other mutant also in permissive and non-permissive conditions in order to observe the male sterile phenotype. The phenotypic analysis was aimed to verify if the mechanism that controls the sterility/fertility restoration remains unaltered changing the geographic area (Chapter 2). All male sterile mutants described in this thesis are characterized by different alteration degrees in anther morphology and in order to understand the genetic relationship between them were carried out different allelism tests. The results indicated the allelism between 7B-1 and sl-2 and between TAP3 and pi-2 (Chapter 3). To identify the candidate gene of 7B-1 mutation, we developed a backcross mapping population after crossing the mutant and S. pennellii. We have characterized the mapping population at molecular level using markers representing the class B MADS box genes or associated to them. The molecular screening showed that the best candidate gene to represent the 7B-1 mutation is the SlGLO2 gene localized on chr. 6. Expression analyses were performed on different flower development stages of the 7B-1 mutant and WT counterparts analyzing genes resulted differentially expressed in mutant genotype from RNA-seq analysis, plus all class B MADS-box genes and other genes known from literature as involved in the regulation network of this family. Results reported in Chapter 4 supported the idea that the candidate gene for 7B-1 mutant is a member of class B MADS-box. The complementation experiment using the WT allele of SlGLO2 gene to transform 7B-1 plants will is ongoing and will possibly confirm that (Chapter 4). In Chapter 5 it is reported the morphological and molecular characterization of other two male sterility mutations, pi-2 and vms, both sensitive to temperature. The phenotype showed by these two mutations is different, in the first case the flower presents a complete conversion of petals into sepals and stamens into carpels, while in the second one the abnormalities regard only the anther structure. The different phenotype suggests the involvement of different class B MADS-box genes. Molecular analysis confirms this. For pi-2 it demonstrated the involvement of SlDEF, while for vms, it was assessed the involvement of the SlGLO1 gene (Chapter 5). Taken together, the results obtained from this thesis give new information which will be useful to elucidate the genetic and molecular basis of the male sterility mutations influenced by the action of environmental factors.La maschiosterilità consiste nella mancata produzione di gameti maschili o nella produzione di gameti maschili non funzionali. La maschiosterilità genetica viene frequentemente utilizzata per la produzione di seme ibrido. L’unico inconveniente legato all’utilizzo di questo tipo di maschiosterilità è il mantenimento della linea maschiosterile, che avviene utilizzando piante di mantenimento e la progenie ottenuta è per metà maschiofertile e per metà maschiosterile. Ciò può essere risolto utilizzando la maschiosterilità condizionale o maschiosterilità genetica sensibile all’ambiente, la quale è basata sull’azione di geni nucleari influenzati da fattori ambientali, temperatura e fotoperiodo. La maschiosterilità condizionale è stata studiata in molte specie vegetali e rappresenta uno strumento utile per la produzione di seme ibrido, in particolare per il riso. In pomodoro sono state identificate diverse mutazioni condizionali sensibili alla temperatura o al fotoperiodo, in particolare vms, pi-2, sl, TAP3 e sl-2 influenzate dalla temperatura e 7B-1 influenzata dal fotoperiodo. Lo scopo di questo progetto di ricerca è la caratterizzazione morfologica e molecolare in pomodoro di mutazioni maschio sterili condizionali influenzate dalla temperatura e dal fotoperiodo. In letteratura sono presenti dati che mostrano similitudine tra il fenotipo dei mutanti omeotici per geni MADS-box di classe B, che controllano l’identità dei petali e degli stami e il fenotipo dei mutanti maschiosterili condizionali. In Arabidopsis thaliana e Antirrhinum majus, sono stati identificati per i MADS-box di classe B due geni, che facendo riferimento alla nomenclatura adottata in A. majus, sono DEFICIENS (DEF) e GLOBOSA (GLO). In pomodoro, come in altre specie appartenenti alla famiglia delle Solanacee, sono stati identificati e caratterizzati quattro geni appartenenti alla famiglia genica dei MADS-box di classe B, SlDEF, TM6, SlGLO1 e SlGLO2. In questo progetto di ricerca l’obiettivo principale è stato quello di identificare e caratterizzare i geni candidati per le mutazioni 7B-1, sl-2, pi-2 e vms, ponendo particolare attenzione alla mutazione 7B-1. 7B-1 è un mutante maschiosterile condizionale sensibile al fotoperiodo, che è stato caratterizzato sia al livello morfologico che molecolare. La caratterizzazione morfologica di 7B-1 è consistita nell’osservare il fenotipo del mutante in condizioni di giorno lungo, in cui si manifesta una condizione di sterilità completa, e in condizioni di giorno corto, dove la fertilità viene parzialmente ripristinata. Data la similitudine fenotipica mostrata da un altro mutante maschiosterile, sl-2, anche per tale mutazione è stata condotta un’analisi morfologica in condizioni in cui la sterilità viene maggiormente espressa e in condizioni invece che favoriscono la ristorazione della fertilità. Tali analisi condotte sia su 7B-1 che sl-2 sono servite per capire se i meccanismi che presiedono all’espressione della sterilità sono mantenuti anche nelle nostre condizioni ambientali di crescita o se cambiando zona geografica essi vanno incontro a modifiche (Capitolo 2). Generalmente, il fenotipo maschiosterile è caratterizzato da modifiche, più o meno evidenti, che riguardano principalmente la struttura delle antere. Per capire l’interazione genetica che intercorre tra i diversi mutanti studiati in questo lavoro sono stati condotti diversi test di allelismo, i quali hanno mostrato allelismo tra le mutazioni 7B-1 e sl-2 e tra TAP3 e pi-2 (Capitolo 3). Non conoscendo la posizione di mappa per la mutazione 7B-1 è stata costituita precedentemente una popolazione di mappa incrociando il mutante con S. pennellii. Questa popolazione è stata analizzata utilizzando marcatori molecolari associati ai quattro geni MADS-box di classe B. I risultati ottenuti mostrano che un marcatore associato al gene SlGLO2 cosegrega con la mutazione. Tali risultati fanno ipotizzare che SlGLO2 sia il candidato per la mutazione 7B-1. Nel mutante 7B-1 e nel corrispettivo genotipo WT, cresciuto in condizioni di giorno lungo è stata fatta un’analisi dei livelli di espressione di tutti e quattro i geni MADS-box di classe B. In entrambi i genotipi è stata condotta anche un’analisi di espressione analizzando diversi stadi di sviluppo fiorale per geni risultati differenzialmente espressi, dopo analisi di RNA-seq, nel mutante rispetto al WT. A questi sono stati aggiunti geni conosciuti da dati riportati in letteratura per essere coinvolti nella regolazione a valle dei geni MADS-box di classe B. I risultati descritti in questo capitolo supportano l’ipotesi iniziale che il gene coinvolto nella mutazione 7B-1 sia SlGLO2. Per confermare ciò sono stati impostati esperimenti volti a dimostrare la complementazione del mutante (Capitolo 4). Il progetto di dottorato ha riguardato anche lo studio di altri mutanti maschiosterili condizionali di pomodoro, pi-2 e vms, sensibili alla temperatura, per i quali è stata fatta un’analisi morfologica e molecolare che ha portato ha identificare putativi geni candidati. L’analisi morfologica ha dimostrato differenze nel fenotipo dei due mutanti. pi-2 è caratterizzato dalla completa trasformazione dei petali in sepali e dagli stami in carpelli, mentre vms è caratterizzato solamente da alterazioni al livello delle antere. Queste differenze hanno fatto ipotizzare il coinvolgimento di geni diversi. Analisi di sequenza hanno confermato ciò e hanno permesso di identificare in SlDEF il candidato per pi-2 e in SlGLO1 un possibile candidato per vms (Capitolo 5). In sintesi, i risultati ottenuti nel presente lavoro hanno fornito nuove informazioni riguardo la conoscenza delle basi genetiche e molecolari delle mutazioni maschiosterili, la cui espressione è influenzata dall’azione di fattori ambientali