Development of bioaugmentation and sewage sludge composting technologies to remove emerging and priority pollutants while reducing their toxicity

About 45 million dry tons of sewage sludge (SS) are produced globally every year and it is estimated to keep increasing, mainly due to the outstanding population growth and the industrial development during the last century. Sewage sludge is a mud-like residue from wastewater treatment which comprises a broad range of trace components, mostly derived from the composition into the influent released from various sources. Among these components, valuable organic matter and nutrients are found in great concentrations and therefore be useful for agricultural purposes. Hence, concerning SS management and disposal system, priority should be given to its valorisation and transformation into a valuable resource always considering potential threats to environmental and public health. Occurrence and presence of several contaminants like heavy metals, pathogens and other organic compounds into the SS are the main reasons for the hesitancy toward SS direct application as an organic amendment. These concerns lead to explore more diverse SS stabilization treatments being ‘composting’ the most used and reliable biological option for minimizing potential environmental impacts. Nonetheless, the threatening estimation of composting technologies is still leery due to the outstanding increment of priority pollutants concentration in the wastewater influent and the lack of information of emerging pollutants (EPs) persistency in the compost after the treatment. Emerging pollutants are synthetic or naturally occurring chemicals and characterized by a perceived, potential, or threat human health. They consists of, among others, pharmaceuticals including antibiotics, personal care products, pesticides, nanoparticles and endocrine disruptors and many of them are currently under investigation to discover exactly how harmful they are or could become. Due to their hydrophobic properties, the EPs are strongly sorbed on sludge and thus, hardly remove from the matrix by conventional stabilization treatments. Moreover, their presence and concentration neither in wastewater nor in composted SS is not often well monitored causing the urgency of an effective regulatory measures. Then, the European Commission has published a more restrictive policy of SS management (Directive 2008/98/EC) and is to update and announce a biennial ‘Watch List’ of substances for Union-wide monitoring. The study of such substances should generate high-quality data that give rise to novel, more effective, straightforward and environmental friendly strategies for SS management focus on its recycling and EPs removal. Within this PhD thesis, diverse bioaugmentation strategies in composting processes are proposed and discussed to remove EPs. Each step of the bioaugmentation design protocol are explained in four different chapters (Screening, characterization and field studies). The screening of EPs degrading microorganisms resulted in different fungal and bacterial isolates and mixed microbial consortia with pharmaceuticals degradation potential without microtoxic effects. The field study comprehend the design, optimization and assembly of a two-step composting technology at industrial scale coupled with bioaugmentation using indigenous and exogenous microorganisms as inoculants. The determination of physicochemical and biological modifications ensued from the inoculation were also explored. Polluted sites are considered to be a great source for the isolation of contaminants degrading microorganisms. Then, chapter 1 is focused on the first step of bioaugmentation regarding the screening of EPs degrading microorganisms that comprises a selective enrichment assay under selective pressure with pharmaceutical compounds (diclofenac, carbamazepine and Ketoprofen) and the further isolation and identification of pure cultures. These compounds were selected based on their persistence after composting processes. Among these microorganisms, fungi Cladosporium cladosporioides H1, Alternaria alternata H4 y Penicillium raistrickii H6 showed the best pharmaceutical degradation rates. Although efficacy of single strains have been observed, employing mixed consortia might benefits the overall degradation performance by broaden the targeted pollutants. This approach was closely studied in chapter 2 through the assembly of an artificial mixed microbial consortia using the BSocial webtool. The three previously mentioned fungi isolates, a proven degrading fungus (Penicillium oxalicum XD 3.1) and coexistence bacteria from the enrichment assay (Micrococcus yunnanensis K1, Oligella ureolytica T4 y Sphingobacterium jejuense T15) were used for the consortia establishment. Because of the social stability, wide range of degrading targets and the lower toxicity level of the artificial consortia consisting of P. raistrickii, P. oxalicum XD 3.1 y C. cladosporoides, A. alternata y M. yunnanensis, this consortium was selected as the most optimal one to use for EPs removal. Although the benefits promised by bioaugmentation technologies for contaminants elimination, its application under real conditions has barely been developed, indeed only 5 % of the studies were focused on organic pollutants degradation have reach the field scale in 30 years until 2020 and only few of them have reported the co-occurrence and simultaneous elimination of different classes of organic pollutants during sewage sludge composting. In chapter 3, details of optimization and installation of a two-steps bioaugmentation-composting system is presented. Two different inoculants were use separately to explore both kinds of bioaugmentation seeds: an exogenous microorganism (P. oxalicum XD 3.1) and a native consortium obtained from enrichment. Both bioaugmented treatments showed great reduction in pharmaceuticals containing and phyto and micro toxicity, as well as offered a better quality, more stable and sanitized mature compost. Biological contributions resulted from the inoculation over native microbial populations and physicochemical parameters were investigated in chapter 4. P. oxalicum XD 3.1 did not modified neither the diversity nor the heterogeneity of native populations regardless of its exogenous nature. Moreover, it promoted the increment of microbial diversity and the physicochemical parameters involved in emerging pollutants degradation.Alrededor de 45 millones de toneladas de lodo seco se producen anualmente en el mundo y se estima que esta cifra ascenderá aún más como consecuencia del aumento de la población y el desarrollo industrial sin precedentes alcanzados durante el último siglo. Los lodos de depuradora poseen una composición variable, la cual depende principalmente de la carga de contaminación del agua residual inicial. En general, estos contienen una amplia diversidad de materia suspendida y disuelta de las cuales se distinguen aquellas con valor agronómico, como los micronutrientes esenciales para el crecimiento vegetal. Los protocolos para su gestión priorizan la valorización y aprovechamiento de estos lodos como enmienda o abono en el sector agronómico, proporcionando un valor al residuo, convertido ya en recurso (siempre en función de los principios de la política de residuos relativos a la protección del medio ambiente y la salud humana). Sin embargo, la presencia de elementos con potencial contaminante como los metales pesados, los agentes patógenos y otros compuestos orgánicos, generan una enorme preocupación y rechazo para su aplicación directa en suelos. Por ende, diversos tipos de tratamientos para la estabilización de este residuo se han propuesto, siendo el compostaje el tratamiento biológico más frecuente para este fin. Si bien, esta técnica permite garantizar la minimización de los riesgos ambientales derivados de su uso en los suelos agrícolas, la creciente presencia de contaminantes prioritarios en los efluentes de las estaciones de depuración de aguas residuales y el desconocimiento y potencial toxicidad de los contaminantes emergentes (CE), aún presentes en el compost maduro, dificulta la estimación de su peligrosidad. El término “contaminante emergente” (CE) engloba una gran variedad de compuestos de diverso origen y naturaleza química cuyos efectos toxicológicos aún son desconocidos en la mayoría de los casos. El número de CEs es indeterminado e incluye, entre otros, a los productos farmacéuticos (incluidos los antibióticos) y de cuidado personal, pesticidas, nanopartículas y disruptores endocrinos. Los CEs se concentran en los lodos de depuradora mediante procesos de sorción y son difícilmente separados o eliminados mediante los tratamientos de estabilización tradicionales. Dado que a diferencia de los contaminantes prioritarios, los CEs no están sometidos a una regulación específica que limite su presencia tanto en aguas residuales como en los lodos compostados, la Comisión Europea estableció una legislación aún más restrictiva de la gestión de los lodos de depuradora (Directiva 2008/98/CE), así como la publicación bienal de la “Lista de Observación” que incluye los CEs que deben analizarse en cada Estado Miembro. Así, el conocimiento y estudio de los CEs proporcionará información sobre la eficacia de su eliminación en las etapas del compostaje, así como la búsqueda y posterior implementación de tecnologías alternativas para la gestión de los lodos, su saneamiento y posterior aprovechamiento. En este trabajo de tesis doctoral se ponen de manifiesto el desarrollo y la aplicación de estrategias de bioaumento en procesos de compostaje de lodos de depuradora, así como el aprovechamiento de cada una de sus etapas de desarrollo (cribado, caracterización y estudio de campo) para la degradación efectiva de diversos CEs, obteniendo aislados fúngicos y bacterianos y consorcios mixtos con potencial de degradación de múltiples CEs. Además, se llevó a cabo un estudio de campo en las instalaciones de EIDER, ecoindustria del reciclado, en Guadix, Granada de un sistema de compostaje de lodos de depuradora acoplado a una técnica de bioaumento con microorganismos autóctonos y alóctonos. Este incluyó tanto su diseño, optimización y montaje en condiciones reales así como los análisis fisicoquímicos (pH, temperatura, humedad, conductividad eléctrica, relación C/N, sólidos volátiles y totales, contenido de materia orgánica total y seca, contenido de carbono orgánico total y seca, materia mineral y materia seca), determinación de macronutrientes, metales pesados, análisis de contaminantes emergentes, fitotoxicidad y modificaciones pre y post inoculación de las comunidades bacterianas y fúngicas nativas. Los sitios contaminados son considerados como una fuente importante de microorganismos con capacidad degradativa de los contaminantes presentes en dicho espacio. Por lo tanto, en el capítulo 1 se aborda la primera etapa del bioaumento referente al cribado de cepas microbianas provenientes de lodos de depuradora. Mediante un ensayo de enriquecimiento bajo presión selectiva con tres compuestos farmacéuticos (diclofenaco, carbamazepina y Ketoprofeno) seleccionados en base a su persistencia después de los procesos de compostaje, se obtuvieron e identificaron diversos aislados fúngicos y bacterianos mediante técnicas cultivables e identificación molecular, cuyos niveles de degradación también se analizaron con técnicas cromatográficas. De los microorganismos identificados, los hongos Cladosporium cladosporioides H1, Alternaria alternata H4 y Penicillium raistrickii H6 mostraron los mejores porcentajes de degradación de los compuestos empleados. Aunque muchos estudios sugieren la efectividad de cepas individuales para la degradación de contaminantes, el empleo de consorcios microbianos amplía el rango y la variedad de CEs que pueden ser degradados. Este acercamiento se explora en el capítulo 2, llevando a cabo el diseño y ensamblaje de co-cultivos mixtos microbianos mediante la herramienta informática B-Social. La composición de cada consorcio se estableció a partir de los tres aislados fúngicos antes mencionados, del hongo Penicillium oxalicum XD 3.1 (previamente estudiado y utilizado para degradación de otros CEs) y de las bacterias coexistentes en el ensayo de enriquecimiento (Micrococcus yunnanensis K1, Oligella ureolytica T4 y Sphingobacterium jejuense T15). Se obtuvo un consorcio artificial compuesto por P. raistrickii, P. oxalicum XD 3.1 y C. cladosporoides, A. alternata y M. yunnanensis cuya estabilidad social, amplio rango de degradación y menores niveles de toxicidad del medio de cultivo resultante (Microtoxicidad en Allivibrio fisherii con Microtox ®) lo definieron como el más adecuado para la eliminación de CEs en medio líquido. El escalado a condiciones reales en un proceso de biorremediación es quizás la etapa más definitiva para la ejecución efectiva de un sistema de bioaumento, siendo los mayores obstáculos las dificultades técnicas en su implementación a gran escala y las complejidades asociadas al uso de sistemas biológicos. En el capítulo 3, se incluyen los detalles de la optimización y montaje de un sistema de compostaje y bioaumento en condiciones reales en dos pasos, utilizando dos tipos de inoculo diferentes (P. oxalicum XD 3.1 y un consorcio nativo obtenido mediante enriquecimiento). Ambos tratamientos resultaron en la reducción del contenido de compuestos farmacéuticos de difícil degradación y en la obtención de un compost maduro más estable, más nutritivo en términos de macro y micronutrientes y menos fitotóxico (analizados mediante ensayos de fitotoxicidad en Lepidium sativum). Por otro lado, las contribuciones microbiológicas en la efectividad del proceso de compostaje gracias a la inoculación se evaluaron en el capítulo 4 empleando técnicas de secuenciación masiva (Illumina Miseq). A pesar de las dificultades que implica la inoculación con microorganismos alóctonos, la utilización de P. oxalicum XD 3.1 como inoculante en la pila de compostaje no produjo ningún efecto negativo en la estabilidad, equilibrio en la funcionalidad, ni cambios en la heterogeneidad de las comunidades microbianas nativas. De hecho, su inoculación presentó mayores beneficios al generar un aumento de la diversidad microbiana (ɑ y ß diversidad) y la mejora de parámetros fisicoquímicos asociados a la degradación de contaminantes.Tesis Univ. Granada.Proyecto del Ministerio de Economía y Competitividad y fondos FEDER [CTM2017-84332-R]Junta de Andalucía FEDER/Junta de Andalucía-Consejería de Transformación Económica, Industria, Conocimiento y Universidades [B-RNM-204-UGR20]CONAHCyT [772485] del programa de becas para estudios de doctorado en el extranjero, MéxicoBeca Talento Edomex en el Extranjero promoción 2019, MéxicoBeca del Plan Propio de Internacionalización, UGR, Españ