Cell derived-extracellular matrix scaffolds with polylactic acid microcarriers for tissue engineering and cell therapy

Organ shortage for transplantation and the need for new therapies for the treatment of tissular damages have driven the development of an exciting field in research, called tissue engineering (TE). Its potential entails future strategies that will allow the development of functional substitutes for damaged tissues, obtained in vitro under riskfree environments, using autologous cells that will integrate within the host aiding in the regeneration and restore of the lost function. However, still current efforts have to deal with several restraints in order to achieve that paradigm. The aim of this thesis focuses in the development of in vitro tissue analogues with millimetric size (microtissues), using the inherent ability of cells to secrete their own extracellular matrix (ECM) when they are seeded on a biocompatible scaffold. In this case, we have used polylactic acid (PLA) microcarriers (MCs) (80 -120 μm in diameter) as scaffold. PLA has been an extensively used as a biomaterial applied in medicine, as it is a biodegradable and biocompatible synthetic polymer. Moreover, we have used a green, non-toxic method for the preparation of PLA MCs that allows a high control over size and distribution. The use of these MCs provides cells with an ideal three-dimensional environment for proliferation and secretion of ECM components, which are different than when exposed to conventional tissue culture plates. Likewise, the use of MCs in the formation of microtissues allows their aggregation (as building blocks) into bigger constructs or macrotissues, with high interconnectivity and porosity, as well as the feasibility to adapt to different shapes. Firstly, in this thesis we have studied different methodologies for the seeding of cells on MCs, and the latter formation of microtissues to define the best parameters for a homogeneous seeding and extensive ECM deposition. For that purpose, we have used a spinner flask bioreactor promoting a more uniform cell-MC colonization, and ECM deposition. After optimization, we have evaluated the obtained ECM microtissues, assessing their components and possible applications. In that case, we introduced the use of commercially available-gelatine microcarriers for a comparative with PLA MCs. We assessed whether the secreted ECM differed when using each MCs type. And we could confirm that the scaffold choice influences cellular behaviour and secreted matrix, favouring osteogenic with gelatine MCs or potentiating angiogenic capacity with a mixture of gelatine and PLA MCs. One of the biggest hurdles that halt the introduction of TE constructs into clinical applications is the vascularization process for the survival of cells once implanted. The arrival of nutrients and oxygen must be favoured by a rapid in vivo vascularization. To aid in this process, we have studied the formation of co-cultured microtissues with mesenchymal stem and endothelial cells, together with PLA MCs. We were able to confirm the presence of both cell types in the microtissues, but there were no clear evidences that the presence of endothelial cells enhanced microtissue vascularization in mice models. Finally, we used cell-derived ECM microtissues as a platform for the introduction and survival of therapeutic cells in an anti-tumoral model. Microtissues acted like a reservoir for these cells, allowing migration towards the tumour providing their bystander therapeutic effect. The results of this study demonstrated the efficiency of PLA microtissues obtained from therapeutic cells in stopping tumour progression. Moreover, a rapid microtissue vascularization was observed, which favoured cell survival. To summarise, this thesis describes the fabrication of cell-derived microtissues, created from seeding cells on PLA microcarriers as a favourable strategy in tissue engineering, as well as a tool for the delivery and survival of therapeutic cells for anti-tumoral applications.La escasez de órganos disponibles para trasplantes y la falta de terapias para el tratamiento de algunas lesiones tisulares han llevado al desarrollo de un campo de investigación muy potente, la ingeniería de tejidos (TE). Futuras estrategias permitirán desarrollar y disponer de nuevos sustitutos para tejidos dañados, construidos de forma segura, a partir de nuestras propias células y totalmente funcionales que se integrarán en nuestro cuerpo ayudando a regenerar y restaurar la función perdida. No obstante, para que este futuro se materialice aún son necesarios muchos esfuerzos que lidien con las limitaciones que de momento nos encontramos. El objetivo de esta tesis es el desarrollo in vitro de análogos de tejidos (microtejidos), utilizando la capacidad de las células de secretar su propia matriz extracelular (ECM) cuando son sembradas sobre un andamio biocompatible. En este caso, hemos utilizado micropartículas de ácido poliláctico (PLA) como andamio. Se trata de un material extensamente aplicado para uso médico, por su biodegradabilidad y biocompatibilidad. Además, para su producción utilizamos reactivos ecológicos y no tóxicos. El uso de estas partículas proporciona a las células un entorno tridimensional ideal para proliferar y secretar proteínas y otros componentes de la ECM, diferentes a cuando se las expone a entornos en dos dimensiones. Asimismo, su uso en TE permite la agregación de diferentes microtejidos para la creación de constructos más grandes, presentando una alta interconectividad y porosidad, así como una elevada facilidad para adaptarse a diferentes regiones. Inicialmente, en esta tesis estudiamos diversos métodos de sembrado y de formación de microtejidos para configurar los parámetros para la obtención de un sembrado extenso y homogéneo. Esto nos llevó a determinar que el uso de un biorreactor de agitación promueve un mejor sembrado cosa que luego conlleva a una secreción más homogénea de ECM por el microtejido. Una vez optimizado, caracterizamos las matrices obtenidas, evaluando sus componentes y sus posibles aplicaciones. En este caso, utilizamos otras micropartículas comerciales para su comparativa con nuestras partículas de PLA. Evaluamos si las matrices obtenidas sembrando las mismas células eran diferentes y pudimos observar, cómo la elección del andamio influye en el comportamiento celular y en la matriz secretada favoreciendo en unos casos la diferenciación osteogénica o en otros su potencial angiogénico. Una de las mayores limitaciones en la aplicación clínica de los constructos de TE, es su vascularización. La llegada de nutrientes y oxígeno debe ser favorecida mediante una rápida vascularización in vivo para la supervivencia de las células del constructo. Para favorecer este proceso, estudiamos la creación de microtejidos cocultivados con células mesenquimales y endoteliales, juntamente con las micropartículas de PLA. Pudimos demostrar la presencia de ambas células en el constructo, aunque no observamos una clara diferencia en cuanto a vascularización una vez implantados en ratones, con la presencia de las células endoteliales y sin ellas. Por último, estudiamos el uso los microtejidos como plataforma para la introducción y supervivencia de células terapéuticas en un modelo subcutáneo tumoral. Los microtejidos actúan como reservorio de estas células, permitiendo la migración hacia el tumor, y así en proximidad provocar su efecto terapéutico. Los resultados de este estudio demostraron la efectividad de los microtejidos de PLA creados por las células terapéuticas, a través de la disminución del volumen de los tumores. Además, pudimos observar una rápida vascularización favoreciendo la supervivencia celular. En conclusión, esta tesis describe la fabricación de microtejidos derivados de células, sembradas sobre partículas de PLA como estrategia favorable para ingeniería de tejidos, así como herramienta para la supervivencia y liberación de células terapéuticas en un modelo anti-tumoral in viv