CD64-mediated specific elimination of M1-polarized macrophages : implications for therapeutic intervention in chronic inflammatory disease: CD64-vermittelte spezifische Elimination von M1-polarisierten Makrophagen : Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention bei chronischen Entzündungskrankheiten

Makrophagen spielen eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem. Durch ihre Flexibilität können sie sich durch Signale aus der Mikroumgebung anpassen, indem sie ihren Polarisierungsstatus sowohl phänotypisch als auch funktional verändern. Das dynamische Verhältnis zwischen M1- und M2-polarisierten Makrophagen ist kritisch für eine kontrollierte Entstehung und Auflösung einer Entzündung. In chronischen Krankheiten ist dieses Verhältnis zu einer M1-Dominanz verschoben. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von CD64-gerichteten Immuntoxinen der Mangel an verfügbaren Therapiestrategien für chronische Entzündungskrankheiten adressiert. Murine und humane Makrophagen wurden polarisiert und unter Verwendung einer Anzahl von membrangebundenen und löslichen Markern charakterisiert. Zusätzlich zu einigen anderen Oberflächenrezeptoren, wie CD14, CD16 und MHCI/II, war CD64 ein geeigneter Marker für murine und humane M1 Makrophagen. M1 Makrophagen wiesen außerdem eine erhöhte Produktion an pro-inflammatorischen Cytokinen wie IL-12, IL-6 und TNF-alpha auf. Im Gegensatz dazu waren eine erhöhte Oberflächenexpression von CD206 und CD301 und eine schwache Produktion von löslichen pro-inflammatorischen Mediatoren charakteristische Merkmale von M2 Makrophagen. In vitro Cytotoxizitätsexperimente resultierten in einer selektiven Elimination von M1 Makrophagen durch drei verschiedene Fusionsproteine: das chimäre immuntoxin H22(scFv)-ETA' und die beiden voll-humanen Fusionsproteine H22(scFv)-Angiogenin und Granzyme B-H22(scFv). Die Anfärbung mit AnnexinV-FITC bestätigte, dass H22(scFv)-ETA' selektiv in M1 Makrophagen Apoptose induziert. M1-spezifische Sensitivität basierte auf einer reduzierten endosomalen Proteaseaktivität. Diese Ergebnisse wurden in vivo in einem transgenen Maushautmodell für SLS-induzierte chronische Hautentzündung und ex vivo in einer Hautbiopsie eines Patienten mit atopischer Dermatitis bestätigt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass beide Makrophagenpopulationen phänotypische und funktionale Plastizität aufwiesen und nach Umpolarisierung nur der M1 Phänotyp sensitiv für das CD64-gerichtete Immuntoxin war. Um das immunogene bakterielle Toxin ETA' mit einem voll-humanen Effektorprotein zu ersetzen, wurde das humane mikrotubuli-assoziierte Protein tau (MAP) auf seine pro-apoptotischen Eigenschaften untersucht. MAP wurde als Fusion mit H22(scFv) kloniert, in E. coli exprimiert und mittels standardmäßiger Chromatographien gereinigt. Die erfolgreiche Bindung von H22(scFv)-MAP an zwei pro-myelocytäre Leukemiezelllinien HL-60 und U937 und an polarisierte Makrophagen wurde mittels Durchflusscytometrie bestätigt. In vitro Cytotoxizitätsexperimente zeigten eine proliferationsabhängige Cytotoxizität von H22(scFv)-MAP. In Analogie zu H22(scFv)-ETA' wurde die in vivo Aktivität von H22(scFv)-MAP im transgenen Mausmodel getestet und resultierte ebenfalls in einer selektiven Elimination von M1 Makrophagen. Die erfolgreiche Elimination von M1 Makrophagen durch H22(scFv)-MAP, welches nur proliferierende Zellen tötet, deutete außerdem darauf hin, dass differenzierte und M1 polarisierte Makrophagen in situ proliferieren. Die lokale Proliferation von M1 Makrophagen wurde immunohistochemischen Analysen bestätigt. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass CD64 ein geeignetes Zielmolekül für M1-spezifische therapeutische Anwendungen darstellt. Ein spezifisches und selektives Ansteuern von M1 Makrophagen stellt daher eine neue therapeutische Interventionsstrategie für viele chronische Entzündungskrankheiten, wie z.B. rheumatoide Arthritis, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen und chronische Wunden, dar