Expression and in vitro characterisation of human Granzyme B-based immunotherapeutics for specific targeting of CD64 + malignancies

Die Akute Myeloide Leukämie (AML) ist eine heterogene Gruppe von Krebserkrankungen des blutbildenden Systems. Ihre Subtypen M4 und M5 sind durch eine erhöhte Expression von CD64 (Fc-gamma-Rezeptor I), dem Hochaffinitäts-Rezeptor für IgG, gekennzeichnet. Während konventionelle Therapieformen wie Chemo- und Radiotherapie unspezifisch Zellen mit hoher Proliferationsrate angreifen und somit unerwünschte Nebeneffekte durch die Elimination gesunder Zellen hervorrufen, können Immuntoxine spezifisch die malignen Zellen binden und abtöten. Die Verwendung humaner Proteinkomponenten, wie beispielsweise der humanen Serinprotease Granzyme B als Toxin, trägt hierbei wesentlich zur Sicherheit und Nebenwirkungsfreiheit eines Immuntoxins bei. In dieser Arbeit wurde das erste humanisierte Granzyme B-basierte Immuntoxin gegen CD64-positive Zellen entwickelt, evaluiert und modifiziert. Als Vorab-Studie hierzu wurde die Sensitivität der AML-verwandten CD64-positiven Zelllinie U937 gegenüber Granzyme B getestet, indem die Zellen mit einem Plasmid transfiziert wurden, welches die cytosolische Expression von Granzyme B erlaubt. Da die Zellen erfolgreich durch Granzyme B abgetötet wurden und somit auch die Effektivität des transfektionsbasierten Testsystems zur Toxinsensitivität gezeigt wurde, wurde das Granzyme B-basierte anti-CD64-Immuntoxin (E)Gb-H22(scFv) konstruiert. Verschiedene Expressionssysteme (E. coli, HEK293T-Zellen, CHO-Zellen, FlpIn-293-Zellen, Apoplast/Chloroplasten/ER von N. tabacum) wurden evaluiert, von denen HEK293T-Zellen schließlich zur Produktion genutzt wurden. Verschiedene Zellkulturformate einschließlich microcarrierbasierter Fermentation wurden etabliert. Das Downstream Processing wurde in Bezug auf die Einfachheit des Handlings, die benötigte Zeit und insbesondere die Reinheit und Integrität des Endprodukts optimiert. Zur Klärung der Rolle eines freien N-Terminus für ein Granzyme B-basiertes Immuntoxin wurde enterokinaseverdautes Gb-H22(scFv) mit unverdautem EGb-H22(scFv) in einem Proteolyseassay mit einem synthetischen Granzyme B-Substrat verglichen. Nur aktiviertes Gb-H22(scFv) zeigte dieselbe proteolytische Aktivität wie freies Granzyme B, wohingegen das unverdaute EGb-H22(scFv) nicht in der Lage war, das synthetische Substrat zu schneiden. Daher wurden die folgenden Experimente auf Gb-H22(scFv) fokussiert, obwohl EGb-H22(scFv) ebenfalls zytotoxische Aktivität zeigte, wenn auch mit etwa zehnfach niedrigeren IC50-Werten als Gb-H22(scFv). Für alle zellbasierten Analysen wurde die Stimulation insbesondere von U937-Zellen mit IFN-gamma im Hinblick auf die Konzentration, den physiologischen Zustand der Zellen (Zeitpunkt der Stimulation nach dem Passagieren) und das Zeitfenster für Zytotoxizitäts-Assays optimiert. Hinsichtlich seiner biologischen Aktivität konnte gezeigt werden, dass Gb-H22(scFv) spezifisch an CD64-positive U937-Zellen, jedoch nicht an CD64-negative Raji-Zellen bindet, und eine potente spezifische Zytotoxizität gegen U937-Zellen mit IC50-Werten zwischen 1,7 und 17 nM aufweist. Diese Werte liegen niedriger als die Majorität der veröffentlichen IC50-Werte anderer Granzyme B-basierter Immuntoxine und demonstrieren somit eine hohe zytotoxische Effizienz. Die Induktion der Apoptose wurde über die Phosphatidylserin-Exposition, die Caspase-3-Aktivierung oder die mitochondriale Depolarisation erfolgreich nachgewiesen, dies sowohl in U937-Zellen als auch in primären mononukleären Zellen des peripheren Blutes eines gesunden Spenders sowie eines Spenders mit Akuter Myeloider Leukämie. Basierend auf diesen In-vitro-Studien wurden optimierte strukturelle Varianten von Gb-H22(scFv) konstruiert, exprimiert und hinsichtlich ihrer Bindeaktivität charakterisiert. In der Zusammenfassung legt diese Arbeit den Grundstein für spätere In-vivo-Experimente zur Charakterisierung von Gb-H22(scFv) und seinen Derivaten