Entwicklung, Optimierung und Charakterisierung anti-CD64-basierter Immuntherapeutika

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung des blutbildenden Systems. Hierbei kommt es zu einer massiven Vermehrung von unreifen, leukämischen Zellen, die sich im Knochenmark und Blut ansammeln. Die Behandlung von AML erfolgt derzeit hauptsächlich mit Chemo- und Radiotherapien. Jedoch gewährleisten diese Therapien keine vollständige Eliminierung von residualen Zellen und führen aufgrund ihrer Unspezifität oftmals zu beträchtlichen Nebenwirkungen. Daher sind alternative Behandlungsstrategien, wie der Einsatz von Immuntoxinen, ein großer Hoffnungsträger. Bei einer Therapie mit Immuntoxinen werden idealerweise spezifisch die Krebszellen eliminiert, ohne einen weiteren schädigenden Einfluss auf den Körper auszuüben. Zellen des AML-Typs M4 und M5 zeichnen sich unter anderem durch eine extrem hohe Expressionsrate des Fc?RI (CD64) Rezeptors aus. Dieser Rezeptor ist daher ein viel versprechendes Ziel zur Behandlung von AML. Ein großer Nachteil vieler bisher entwickelter Immuntoxine ist ihre potentielle Immunogenität bei der Applikation im Menschen. Dieses ist auf die bakteriellen oder pflanzlichen Komponenten dieser Immuntoxine zurückzuführen. Um diese Problematik zu beheben, wurde in dieser Arbeit ein vollständig humanisiertes Immuntoxin entwickelt, welches keinerlei Immunogenität im Menschen aufzeigen dürfte. Hierzu wurde das humanisierte Single Chain Antikörper Fragment h22(scFv) an die humane RNase Angiogenin fusioniert. Da humane Effektorproteine jedoch nicht, wie viele der bakteriellen oder pflanzlichen Toxine, über eine natürliche Translokationsdomäne verfügen, sind diese zum Teil von geringerer Toxizität. Aus diesem Grund sollte dass neu entwickelte humane Immuntoxin h22(scFv)-Ang mit Hilfe eines funktionalen Adapters hinsichtlich der endosomalen Freisetzung optimiert werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktionalität eines multifunktionalen molekularen Adapters im direkten Vergleich zu der natürlichen Translokationsdomäne vom Pseudomonas Exotoxin A untersucht. Hierzu wurden zwei Konstrukte h22(scFv)-ETAm und h22(scFv)-AD(emc)-ETAm kloniert, welche beide eine deletierte Form des ETA ohne Translokationsdomäne (ETAm) als toxischen Bestandteil beinhalten. Beide Konstrukte wurden periplasmatisch unter osmotischen Stress in Anwesenheit von kompatiblen Soluten in E.coli exprimiert und gereinigt und umfassend charakterisiert. Hierbei zeigt sich, dass das Konstrukt h22(scFv)-AD(emc)-ETAm mit einer IC50 von 0,5 nM eine vergleichbar hohe Toxizität gegenüber CD64 positiven U937 Zellen aufwies wie das Ursprungs- und Referenzkonstrukt h22(scFv)-ETA’. Die Zytotoxizität des ETA-Konstruktes ohne Translokationsdomäne und ohne Adapter (h22(scFv)-ETAm) dagegen war mit einer IC50 von 10 nM deutlich um 90% gesenkt. Die Funktionalität des Adapters AD(emc) konnte somit bestätigt werden, so dass in einem weiteren Schritt nun die Entwicklung und Optimierung eines humanen anti-CD64 Konstruktes durch die Integration dieses Adapters erfolgen konnte. Im Folgenden wurden die Immuntoxine h22(scFv)-Ang und h22(scFv)-AD(emc)-Ang generiert, exprimiert und charaktierisiert. Das Konstrukt h22(scFv)-AD(emc)-Ang wies ein hohes zytotoxische Potential mit einer IC50 von 0,01 nM auf, wohingegen das Konstrukt h22(scFv)-Ang lediglich eine IC50 von 0,2 nM erzielte. Die Integration des funktionalen Adapters führte somit zu einer 20-fachen Steigerung der Zytotoxizität gegenüber dem Ursprungskonstrukt. Jedoch zeigte sich, dass die Stabilität dieses Konstruktes erheblich reduziert war. Da für disseminierte Tumorerkrankungen ein Immuntoxin von hoher Stabilität von Vorteil ist, wurde der Adapter AD(emc) modifiziert. Hierbei wurde das Konstrukt h22(scFv)-AD(mc)-Ang generiert, bei dem das endosomal spaltbare Peptid deletiert worden war. Nach der erfolgreichen Expression und Reinigung dieses Fusionsproteins zeigte sich, dass das zytotoxische Potential mit einer IC50 von 0,01 weiterhin 10-fach höher lag als das Potential von h22(scFv)-Ang, wobei die Stabilität im Serum die des Konstruktes h22(scFv)-AD(emc)-Ang um ein Vielfaches übertraf. Abschließend wurde in Hinblick auf zukünftige in vivo Versuche der Effekt der Angiogen basierten Immuntoxine auf primäre Milzzellen von transgenen humanen CD64 positiven Mäusen untersucht sowie die Art des durch die Immuntoxine induzierten Zelltodes. Hier zeigte sich, dass jedes der getesteten Immuntoxine spezifisch CD64 positive Makrophagen eliminierte und dass alle Angiogenin basierten Immuntoxine Apoptose induzierten. Damit wurden die Grundlagen für zukünftig folgende in vivo Experimente geschaffen