EPR spectroscopic investigation of membrane protein structure and folding on light harvesting complex LHCIIb

Structure and folding of membrane proteins are important issues in molecular and cell biology. In this work new approaches are developed to characterize the structure of folded, unfolded and partially folded membrane proteins. These approaches combine site-directed spin labeling and pulse EPR techniques. The major plant light harvesting complex LHCIIb was used as a model system. Measurements of longitudinal and transversal relaxation times of electron spins and of hyperfine couplings to neighboring nuclei by electron spin echo envelope modulation(ESEEM) provide complementary information about the local environment of a single spin label. By double electron electron resonance (DEER) distances in the nanometer range between two spin labels can be determined. The results are analyzed in terms of relative water accessibilities of different sites in LHCIIb and its geometry. They reveal conformational changes as a function of micelle composition. This arsenal of methods is used to study protein folding during the LHCIIb self assembly and a spatially and temporally resolved folding model is proposed. The approaches developed here are potentially applicable for studying structure and folding of any protein or other self-assembling structure if site-directed spin labeling is feasible and the time scale of folding is accessible to freeze-quench techniques.Die Bestimmung der Struktur und Faltung von Membranproteinen ist eine wichtige Fragestellung der Molekular- und Zellbiologie. In dieser Arbeit werden neue Ansätze entwickelt, um Strukturinformation für gefaltete, ungefaltete und teilweise gefaltete Membranproteine zu erhalten. Diese Ansätze basieren auf der Methode der Puls-EPRSpektroskopie, die mit einer selektiven Markierung spezifischer Aminosäurereste durch Nitroxidradikale kombiniert wird. Dabei dient der für die Photosynthese bedeutsame Hauptlichtsammelkomplex LHCIIb grüner Pflanzen als Modellsystem. Messungen der longitudinalen und transversalen Relaxationszeit der Electronenspins und Hyperfeinkopplungen zu benachbarten Kernspins mittels Echoenveloppenmodulation(ESEEM) liefern komplementäre Information bezüglich der lokalen Umgebung der spinmarkierten Seitengruppen. Mittels gepulster Doppel-Elektronen-Elektronen-Resonanz(DEER) können Abstandsverteilungen im Nanometerbereich zwischen zwei spinmarkierten Aminosäureresten gemessen werden. Mit diesen Methoden konnten die relative Wasserzugänglichkeit verschiedener Positionen in LHCIIb und dessen Geometrie in Detergenzmicellen bestimmt und Konformationsänderungen in Abhängigkeit von der Micellenzusammensetzung detektiert werden. Dieses Methodenarsenal wurde dann in der Untersuchung der Proteinfaltung während der Sebstorganisation von LHCIIb angewandt. So konnte ein orts- und zeitaufgelöstes Faltungsmodell aufgestellt werden. Die entwickelten Ansätze sind prinzipiell auf Struktur- und Faltungsuntersuchung beliebiger Proteine oder anderer selbstorganisierender Systeme anwendbar, wenn eine selektive Markierung mit geeigneten Radikalen möglich ist und die relevante Zeitscala es erlaubt, Faltung bzw. Sebstorganisation durch Schockfrieren zu stoppen