Spin labeling strategies to study protein conformational changes and interaction networks via EPR spectroscopy

Elektronenparamagnetische Resonanz (EPR) Spektroskopie Techniken besonders im Bereich der ortsspezifischen Spin-Markierung von Proteinen haben sich den letzten Jahren weiterentwickelt und erlauben neue Einblicke in die Struktur und Funktion von Proteinen. In dieser Arbeit wurden DEER Distanzmessungen an Phytochromen durchgeführt. An Cph2 habe ich licht-induzierte Konformationsänderungen untersucht und ein Model zu diesen erarbeitet. Außerdem habe ich 3-pulse ESEEM Messungen an spin-markierten und membrane-ständigen Varianten des pro-apoptotischen Bax durchgeführt, und die Wasserzugänglichkeit verschiedener Spin-Sonden untersucht. Ich charakterisiere zusätzlich bei EPR zwei neue Spinsonden. Um ihre Nützlichkeit der Sonden für strukturbiologische Messungen zu testen, wurde eine neue Rotamer-Bibliothek programmiert. Die Nutzung von orthogonalen und reduktions-resistenten Spinsonden soll zusätzlich Messungen in der physiologischen Umgebung der Bcl-2 Proteine (also in Zellen) ermöglichen.Recently, there have been many advancements in site-directed spin labeling and electron paramagnetic resonance (EPR) as tools for understanding protein structure-function relationships. In this thesis, the light-induced conformational changes of a minimal photosensory unit of phytochrome Cph2 were modelled based on Q Band DEER distance measurements. I used 3-pulse ESEEM measurements to monitor the water accessibility of spin-labeled sites within the pro-apoptotic Bcl-2 protein Bax in the active membrane-embedded conformation. I characterized two new bioresistant nitroxide labels by EPR. New rotamer libraries of the labels are also tested, fostering use in structural biology. Orthogonal spin labeling using reduction-resistant spin labels from different paramagnetic species will pave the way for experiments that can measure structural information between the multiple protein interaction partners in the Bcl-2 family interactome in their native cellular environment