Structural analysis of the major lightharvesting complex II by electron paramagnetic resonance (EPR) : comparison between monomers and trimers

Der Haupt-Lichtsammenkomplex II (LHCII) höherer Pflanzen ist das häufigsternMembranprotein der Welt und in die chloroplastidäre Thylakoidmembran integriert. DerrnLHCII kann als Modellsystem genutzt werden, um die Funktionsweise vonrnMembranproteinen besser zu verstehen, da 96 % seiner Struktur kristallografisch aufgelöstrnist und er in rekombinanter Form in vitro rückgefaltet werden kann. Hierbei entsteht einrnvoll funktionaler Protein-Pigment.Komplex, der nahezu identisch mit der in vivo Varianternist.rnElektronenparamagnetischen Resonanz (EPR) Spektroskopie ist eine hoch sensitive undrnideal geeignete Methode, um die Strukturdynamik von Proteinen zu untersuchen. Hierzurnist eine ortsspezifische Markierung mit Spinsonden notwendig, die kovalent an Cysteinernbinden. Möglich wird dies, indem sorgfältig ausgewählte Aminosäuren gegen Cysteinerngetauscht werden, ohne dass die Funktionsweise des LHCII beeinträchtigt wird.rnIm Rahmen dieser Arbeit wurden die Stabilität des verwendeten Spinmarkers und diernProbenqualität verbessert, indem alle Schritte der Probenpräparation untersucht wurden.rnMithilfe dieser Erkenntnisse konnte sowohl die Gefahr einer Proteinaggregation als auchrnein Verlust des EPR Signals deutlich vermindert werden. In Kombination mit derrngleichzeitigen Etablierung des Q-Band EPR können nun deutlich geringer konzentrierternProben zuverlässig vermessen werden. Darüber hinaus wurde eine reproduzierbarernMethode entwickelt, um heterogene Trimere herzustellen. Diese bestehen aus einemrndoppelt markierten Monomer und zwei unmarkierten Monomeren und erlauben es, diernkristallografisch unvollständig aufgelöste N-terminale Domäne im monomeren undrntrimeren Assemblierungsgrad zu untersuchen. Die Ergebnisse konnten einerseits diernVermutung bestätigen, dass diese Domäne im Vergleich zum starren Proteinkern sehrrnflexibel ist und andererseits, dass sie in Monomeren noch mobiler ist als in Trimeren.rnZudem wurde die lumenale Schleifenregion bei unterschiedlichen pH Werten undrnvariierender Pigmentzusammensetzung untersucht, da dieser Bereich sehr kontroversrndiskutiert wird. Die Messergebnisse offenbarten, dass diese Region starre und flexiblerernSektionen aufweist. Während der pH Wert keinen Einfluss auf die Konformation hatte,rnzeigte sich, dass die Abwesenheit von Neoxanthin zu einer Änderung der Konformationrnführt. Weiterführende Analysen der strukturellen Dynamik des LHCII in einerrnLipidmembran konnten hingegen nicht durchgeführt werden, da dies eine gerichteternInsertion des rückgefalteten Proteins in Liposomen erfordert, was trotz intensiverrnVersuche nicht zum Erfolg führte.The major light harvesting complex II (LHCII) of higher plants is the most abundantrnmembrane protein on earth and located in the thylakoid membrane of chloroplasts. It is arnperfect model system to analyze membrane protein function because 96 % of its structurernis resolved by X-ray crystallography and its recombinant version can be refolded in vitro,rnleading to a full-functional protein-pigment complex that is nearly identical to the in vivornversion.rnElectron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is a very sensitive and well suitedrnmethod to analyze structural dynamics of proteins. EPR requires a site-directed spinrnlabeling to Cys residues that replace carefully chosen amino acids of the LHCII withoutrninfluencing its function.rnIn this work the stability of the spin label and the quality of labeled samples wasrnoptimized by analyzing each preparation step. Results were used to establish a method,rnwhich avoids the risk of protein aggregation and a loss of EPR signal extremely. Inrncombination with Q-band EPR low concentrated LHCII samples are now detectable.rnFurthermore, a reproducible method for the production of heterogeneous trimers,rnconsisting of one double labeled monomer and two unlabeled monomers, was established.rnHeterogeneous trimers were used to compare the incompletely resolved N-terminalrndomain in both assembly states. On one hand results of both assembly states showed arnlimited mobility in the section near to the rigid core and an increasing flexibility in itsrnfurther course to the N-terminus. On the other hand results confirmed the suggestion thatrnsections near the N-terminus are less flexible in trimers than in monomers. Comparisonsrnof several mutants under varied pH values and pigment compositions were used to analyzernthe controversially discussed lumenal loop region of the LHCII. Measurements showedrnthat this region consists of rigid and flexible parts independently of the pH value, whereasrna loss of neoxanthin by contrast changes the conformation. Additional analyses of thernstructural dynamic of the LHCII by mimicking the in vivo situation were impossiblernbecause a unidirectional insertion of the refolded protein into liposomes failed