Elimination of apoptotic cells by professional phagocytes: Generation, release and recognition of the monocytic attraction signal lysophosphatidylcholine and importance of annexin I as a bridging protein in the phagocytic synapse

Die effiziente Eliminierung apoptotischer Zellen durch Phagozyten ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase in mehrzelligen Organismen. Dazu werden von apoptotischen Zellen verschiedene Phagozytose- oder ?eat-me?-Signale auf der Oberfläche präsentiert, die für die Erkennung und Internalisierung entscheidend sind. In höheren Organismen sind die sterbenden Zellen und die Phagozyten jedoch oft nicht direkt nebeneinander lokalisiert; deshalb kommt hier der Freisetzung von löslichen Attraktionssignalen eine besondere Bedeutung zu. Als ein zentrales ?find-me?-Signal konnte Lysophosphatidylcholin (LPC) identifiziert werden, das durch die hydrolytische Spaltung von Phosphatidylcholin mittels der Calcium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2) entsteht. Dabei wird die iPLA2 während der Apoptose Caspase-3-abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung von iPLA2 direkt durch Caspase-3 geschieht und zu deren Aktivierung führt. Die aktive iPLA2 ist dabei essentiell für die Produktion des Attraktionssignals LPC in apoptotischen Zellen. Da die Expression von aktiver iPLA2 in vitalen Zellen jedoch nicht zu einer Freisetzung des Attraktionssignals führte, musste angenommen werden, dass weitere apoptotische Ereignisse an der Generierung und dem Export von LPC beteiligt sind. Es zeigte sich, dass die Oxidation von Membranlipiden, wie Phosphatidylcholin, durch reaktive Sauerstoffverbindungen ein zusätzlicher Faktor ist, der zur verstärkten Produktion von LPC beiträgt - vermutlich weil peroxidierte Lipide anfälliger für eine PLA2-vermittelte hydrolytische Spaltung sind als nicht-oxiderte. Weitere Untersuchungen zum genauen Exportmechanismus von LPC ergaben, dass das ABC (ATP-binding cassette transporter)-Familienmitglied ABCA1 essentiell für die Freisetzung des Attraktionssignals während der Apoptose ist. Somit konnten mit der Lipidoxidation und dem ABCA1-vermittelten LPC-Export weitere entscheidende Elemente der LPC-Produktion und anschließenden Freisetzung dieses ?find-me?-Signals während der Apoptose charakterisiert werden. Nachdem die Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals LPC näher aufgeklärt werden konnte, stellte sich die Frage, welche Rezeptoren die Wirkung von LPC auf den Phagozyten vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der G-Protein-gekoppelte Rezeptor G2A verantwortlich ist für die Migration von Monozyten auf das Attraktionssignal LPC. Die molekularen Mechanismen, die letztendlich zur LPC-stimulierten, G2A-vermittelten Migration führen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Auch eine Beteiligung anderer Rezeptoren an der LPC-vermittelten Anlockung von Phagozyten oder das Vorhandensein weitere chemotaktisch aktiver Signale kann hier nicht ausgeschlossen werden, zumal sich in der Literatur einige Hinweise auf chemotaktisch aktive Proteine finden. Ob diese oder weitere Faktoren im Zusammenhang mit der LPC-vermittelten Chemotaxis monozytärer Zellen stehen, ist bis jetzt jedoch nicht untersucht. Die Erkennung und Internalisierung sterbender Zellen erfolgt über die Interaktion von verschiedenen auf apoptotischen Zellen vorhandenen ?eat-me?-Signalen mit spezifischen Oberflächenrezeptoren von Phagozyten, wobei diese Interaktion direkt oder indirekt über Brückenproteine stattfindet. In diesem Zusammenhang konnte hier gezeigt werden, dass das Calcium- und Phospholipid-bindende Protein Annexin I von apoptotischen Zellen externalisiert wird, und zwar unabhängig vom verwendeten Apoptose-Stimulus, jedoch Zelltyp-abhängig. Die Bindung von Annexin I auf der Oberfläche der sterbenden Zelle erfolgt Calcium-abhängig über die Annexin-Boxen an ebenfalls externalisiertes Phosphatidylserin, das ein zentrales Phagozytose-Signal darstellt. Dadurch kann Annexin I die Eliminierung dieser Zellen durch professionelle Phagozyten stimulieren und erfüllt somit die Funktion eines Brückenmoleküls in der phagozytotischen Synapse. Über welche Rezeptoren Annexin I dabei von Phagozyten erkannt wird, ist dagegen bis jetzt nicht klar. Insgesamt stellen die hier untersuchten Phänomene wichtige Schritte bei der effizienten Eliminierung apoptotischer Zellen dar, die dazu beiträgt, dass der apoptotische Zelltod, im Gegensatz zur Nekrose, ohne schädigende Nebenwirkungen für den Gesamtorganismus abläuft. Ist dieser komplexe, mehrstufige Prozess gestört, können nicht-eliminierte apoptotische Zellen zur Quelle für inflammatorische Reaktionen werden. In verschiedenen Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass sowohl Defekte bei der Anlockung von Phagozyten als auch bei der Erkennung und Internalisierung durch ?eat-me?-Signale und der anschließenden Degradation der apoptotischen Zellen Ursache für die Entwicklung schwerer Autoimmunerkrankungen sein können. Auch die Entstehung des humanen systemischen Lupus erythematodes und von rheumatoider Arthritis wird inzwischen mit der unzureichenden Eliminierung apoptotischer Zellen in Zusammenhang gebracht.The efficient elimination of apoptotic cells by neighbouring cells or professional phagocytes is essential for tissue homeostasis in multicellular organisms. Therefore, the apoptotic cell displays different so-called ?eat-me?-signals on its cell surface that are crucial for its recognition and engulfment. Especially in higher organisms, where the dying cell and the phagocyte are usually not located in immediate proximity, the release of soluble attraction signals is of special importance. Only recently, the phospholipid lysophosphatidylcholine (LPC) could be identified as a central ?find-me?-signal that is generated by the calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2)-mediated hydrolysis of phosphatidylcholine. During apoptosis iPLA2 is processed in a caspase-3-dependent fashion. In the present thesis it could be demonstrated that iPLA2 is cleaved directly by caspase-3 and that this processing leads to its activation. The active iPLA2 is essential for the production of the phospholipid-?find-me?-signal LPC in apoptotic cells. However, the observation that overexpression of the active form of iPLA2 alone was not sufficient for the release of the attraction signal from vital cells implied that other apoptotic events might contribute to the generation and export of the ?find-me?-signal LPC. It turned out that the reactive oxygen species-driven oxidation of membrane lipids like phosphatidylcholine is an additional factor that leads to the enhanced production of LPC, probably because oxidized lipids are more susceptible for PLA2-mediated hydrolysis than non-oxidized lipids. Further studies about the detailed export mechanism of LPC revealed that the ATP-binding cassette transporter (ABC)-family member ABCA1 is essential for the release of the attraction signal during apoptosis. Thus, the oxidation of membrane lipids and the ABCA1-driven export of LPC could be identified as important elements of LPC-generation and its subsequent release during apoptosis. After the generation and the release of the attraction signal LPC could be demonstrated in more detail the consequent question arose which receptors might mediate the effects of LPC on the phagocytes. In the present thesis it could be demonstrated that the G-protein-coupled receptor G2A is responsible for the LPC-stimulated migration of monocytic cells. However, the molecular mechanisms that ultimately lead to the LPC-driven, G2A-mediated migration, are not known so far. Accordingly, a participation of other receptors or the existence of further chemotactic signals cannot be ruled out at this point. Moreover, there are some hints for chemotactically active proteins in literature. If these or other factors contribute to the LPC-mediated chemotaxis of monocytic cells is completely unknown and needs to be clarified in future studies. The recognition and internalization of dying cells is mediated by the interaction between different ?eat-me?-signals that are displayed on apoptotic cells, and specific surface receptors on phagocytes. In this scenario, the interaction can be of a direct nature ore rather indirect via bridging molecules. In this context, here it could be demonstrated that the calcium- and phospholipid-binding protein annexin I gets externalized by dying cells independently of the apoptotic stimulus applied, but dependent on the cell type. On the surface of the apoptotic cell, annexin I binds in a calcium-dependent fashion via its annexin-boxes to externalized phosphatidylserine, which represents a central ?eat-me?-signal. Thereby, annexin I is able to stimulate the elimination of these cells by professional phagocytes and thus fulfills the function of a bridging molecule in the phagocytic synapse. In contrast, the receptors that are responsible for the binding of annexin I to phagocytes are not known so far. As a conclusion it can be stated that the phenomena studied in this thesis represent important steps in the process of apoptotic cell elimination. The physiological relevance of apoptotic cell clearance is the fact that apoptosis, in contrast to necrotic cell death, is highly regulated at all stages and usually turns out without any harmful consequences to the organism. If this complex, multistep process is disturbed, non-cleared apoptotic cells can become a source for inflammatory reactions. In different animal models it could be demonstrated that defects in the attraction of phagocytes as well as deficiencies in the recognition and internalization via ?eat-me?-signals and the subsequent degradation of the apoptotic prey can be a reason for the onset of severe autoimmune disorders. In this context, the development of human systemic lupus erythematosus and of chronic arthritis is discussed to be initiated by the inefficient elimination of apoptotic cells