Anti-inflammatory signaling pathways after phagocytosis of apoptotic cells in macrophages

Die Phagozytose apoptotischer Zellen ist ein essentieller Schritt bei der Embryogenese und dem Erhalt der Gewebehomöostase. Phagozyten beseitigen dabei nicht nur die sterbenden Zellen und verhindern damit eine Freisetzung immunogener zellulärer Bestandteile ins umliegende Gewebe, sondern unterdrücken aktiv pro-inflammatorische Antworten, wie die Sekretion von TNFalpha oder die Produktion von NO. Das Wissen über die zugrunde liegenden Prozesse und Mechanismen ist noch lückenhaft. Auch wenn bereits eine Vielzahl von beteiligten Rezeptoren und Reaktionen der Phagozytenzellen auf apoptotische Zellen (AZ) bekannt sind, sind die verantwortlichen und vermutlich sehr komplexen Signalwege noch relativ wenig erforscht. Die Produktion von kleinen reaktiven Molekülen wie NO oder Sauerstoffradikale (ROS) durch Makrophagen ist ein initialer Schritt zur Bekämpfung von Pathogenen. Zu Beginn meiner Promotion lagen noch keinerlei Daten bezüglich eines Einflusses apoptotischen Materials auf die ROS-Produktion aktivierter Makrophagen vor. Der grundlegende anti-inflammatorische Makrophagenphänotyp nach der Phagozytose von AZ führte zur Hypothese, dass auch diese durch AZ beeinflusst würde. Diese Überlegung bildete den Ausgangspunkt für meine Studien: Zunächst gelang es mir, ein Testsystem zur Untersuchung anti-inflammatorischer Effekte in Makrophagen nach der Phagozytose von AZ zu etablieren. Dabei konnte ich zeigen, dass die von mir verwendeten apoptotischen Jurkat-Zellen von murinen RAW264.7-Makrophagen aufgenommen werden und deren pro-inflammatorische Antwort, gemäß der Literatur, zu hemmen vermögen. In durchflusszytometrischen Untersuchungen konnte ich mittels eines Redox-sensitiven Farbstoffs zeigen, dass AZ im Gegensatz zu nekrotischen oder vitalen Zellen die TPA-vermittelte ROS-Produktion in Makrophagen inhibieren. Sowohl durch EMSA und Western Blot-Analysen, als auch durch die Verwendung von d/n PPARgamma und PKCalpha-überexprimierenden Makrophagen, konnte ich nachweisen, dass die initiale Hemmung des ‚oxidative burst’ (innerhalb 1 Stunde) über eine PPARgamma-induzierte Inhibition der PKCalpha-vermittelt wird. Für diese reicht eine Bindung von AZ an die Makrophagen aus, während zu späteren Zeitpunkten andere, noch unbekannte Faktoren involviert scheinen. Dieser Mechanismus scheint auch in primären humanen Makrophagen von Bedeutung zu sein. Die Beobachtung, dass es nach der Behandlung aktivierter Makrophagen mit AZ zu einer verminderten IFNgamma-vermittelten NO-Produktion bei stark exprimierter iNOS kommt, ließ die Theorie zu, dass nicht - wie bisher vermutet - TGFbeta für diesen Effekt verantwortlich ist. Auch hier gelang es mir, neue Erkenntnisse über den zugrunde liegenden Mechanismus der AZ-vermittelten NO-Inhibition zu erlangen: Mittels eines Aktivitäts-Assays und durch Einsatz des spezifischen Arginaseinhibitors nor-NOHA konnte ich zeigen, dass der Einfluss von AZ auf aktivierte Makrophagen nicht etwa deren iNOS-Aktivität verringert, sondern vielmehr aus einer erhöhten Arginaseaktivität resultiert. Diese führt scheinbar zu einer verminderten Substratverfügbarkeit für die iNOS und hemmt so die NO-Produktion. Western Blot- und quantitative PCR-Versuche zeigten eine erhöhte Arginase II-Expression nach Stimulation mit AZ, welches ebenfalls meine Theorie unterstützt. Ferner konnte ich durch den Einsatz von AZ-konditioniertem Medium zeigen, dass ein noch unbekannter, von AZ sekretierter löslicher Faktor für die Hemmung der NO-Produktion verantwortlich ist. Die Beobachtung einer sehr frühen COX-2-Expression nach der Inkubation von Makrophagen mit AZ und das Nichtvorhandensein entsprechender Beobachtungen in der Literatur führten dazu, dass ich mich im letzten Teil meiner Arbeit mit dem hierfür verantwortlichen Mechanismus befasste: Unter Verwendung eines Luziferase-Assays, bei dem das Luziferasegen mit der 3´-UTR oder AREs des COX-2-Gens gekoppelt war, konnte ich zeigen, dass - wie schon bei der Inhibition der NO-Produktion durch die Arginase II - ein von AZ sekretierter löslicher Faktor für eine schnelle, AZ-spezifische und höchstwahrscheinlich durch COX-2-mRNA-Stabilisierung vermittelte Proteinexpression verantwortlich war. Eine schnelle Erhöhung der COX-2-mRNA nach AZ-Stimulus sowie jüngste Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe, welche eine erhöhte COX-2-mRNA-Halbwertszeit zeigen, unterstützen diese Hypothese. Die von mir gewonnenen neuen Erkenntnisse über die Makrophagenreprogrammierung nach der Erkennung von AZ tragen zu einem tieferen Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Mechanismen bei. Es besteht die hoffnungsvolle Aussicht, dass das Verstehen und die Manipulation der ablaufenden Prozesse bei der Phagozytose von AZ eines Tages einerseits neue Therapiemöglichkeiten zur Behandlung von Infektions- und Autoimmunkrankheiten und andererseits verbesserte Strategien zur Bekämpfung von Krebs ermöglichen werden.The phagocytosis of apoptotic cells is an essential step in embryogenesis and maintenance of tissue homeostasis. Phagocytes not only remove dying cells and thereby avert the release of potential immunogenic cellular constituents into the surrounding tissue, but actively attenuate pro-inflammatory cell answers like the release of TNFalpha or NO production. Today the knowledge about the underlying mechanisms is still fragmentary. Even if there is a relative good knowledge about the different receptors which are involved in the phagocytic process and phagocyte answers, the presumably very complex signalling pathways which are underlying are comparatively poor investigated. The production of reactive molecules like nitric oxide (NO) or Reactive oxygen species (ROS) by macrophages is a basal and initial step in the defence against pathogens. At the beginning of my PhD-work there was nothing known about the influence of apoptotic material on ROS production in activated macrophages. The basic anti-inflammatory macrophage phenotype after phagocytosis of apoptotic cells (AC) led me to the hypothesis that ROS production is influenced by phagocytosis of AC. This consideration was the starting point of my studies: Initially I was able to establish a suitable testing system for the exploration of the phagocytosis of apoptotic cells. Thereby I could show that murine RAW264.7 Macrophages take up apoptotic Jurkat cells and also lead to described anti-inflammatory cell answers. Performing flow cytometry analysis with a redox sensitive fluorescence dye I could show that AC but not necrotic cells (NC) led to an attenuation of PMA induced ROS production in macrophages. Using EMSA, western blot analysis and dominant negative PPARgamma cells as well as PKCalpha-overexpressing cells I could demonstrate that a PPARgamma induced inhibition of PKCalpha is responsible for the initial inhibition of the oxidative burst. For this effect the binding of AC to macrophages is sufficient. This mechanism seems to be also of importance in primary human macrophages. The observance that treatment of macrophages with AC leads to inhibited IFNgamma induced NO production while iNOS protein is still expressed at high levels led to the hypothesis that TGFbeta is not the main factor responsible for this effect (like suggested in literature). Here I could also get some new cognitions about the mechanism underlying AC induced NO inhibition: Performing western blot and PCR analysis and using an activity assay and a specific arginase inhibitor I could show that inhibition of NO production results from an increased arginase II expression and activity which reduces substrate availability for iNOS and thereby inhibits NO production. Further I could demonstrate that the NO inhibition effect is mediated by a jet unknown factor secreted by AC. The observation of a very early induction of COX-2 expression after incubation of macrophages with AC gave rise to the following experiments: Using reporter gene assays in which the luciferase was coupled with the 3´-UTR or ARE of the COX-2 gene I could show that it is likely that a factor secreted by AC leads to an increased COX-2 mRNA stability and thereby to increased protein expression levels. Hopefully a better understanding of the processes which are involved in the phagocytosis of apoptotic cells will lead to new therapeutical approaches in the treatment of inflammatory- and autoimmune diseases as well as the treatment of cancer in the future