Funktion und Regulation von pflanzlichen Mitogen-aktivierten Proteinkinasen in metabolischen und Stress Signalwegen

In Pflanzenzellen ist die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Protein (MAP) Kinasen eine allgemeine Reaktion zur abwehrvermittelten Signaltransduktion. Da die nachgeschalteten Prozesse der Aktivierung der MAP Kinasen in Pflanzen weitestgehend unbekannt sind,wurde die Rolle der MAP Kinasen in Abhängigkeit von stressvermittelnden Stimuli auf die Abwehrmechanismen und den primären Kohlenhydratmetabolismus in Tomate untersucht. Dabei wurde die Beziehung zwischen MAP Kinasen (LpMPK2 und LPMPK3) und der extrazellulären Invertase Lin6, welche ein Schlüsselenzym der apoplastischen Phloementladung darstellt, analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die mRNAs von LpMPK3 und Lin6 sequenziell durch dieselben stressvermittelnden Stimuli (E-Fol, PGA,Verwundung, KCl) induziert werden. Die Induktion des Lin6 Promotors, erkennbar durch eine erhöhte β-Glucuronidase Aktivität 2 Stunden nach Behandlung der Reporterlinien mit Stimuli, war abhängig von der Expression und Aktivierung der LpMPK3. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Induktion von der extrazellulären Invertase Lin6 durch stressvermittelnde Stimuli LpMPK3 bedarf. Die Behandlung mit Glukose zeigte eine gleichzeitige Induktion der AtMPK4 und AtMPK6 Aktivität, welche durch Anionen-Austausch-Chromatographie separiert und mit Hilfe von spezifischen MAP Kinase Antikörpern nachgewiesen werden konnten. Zusammengefasst lassen diese Daten vermuten, dass die Aktivierung der MAP Kinasen eine zentrale Rolle in der Zucker vermittelten Signalübertragung spielt. Die Bewegung der Stomata wird durch umweltbedingte Einflüsse wie ichtintensität, Luftfeuchtigkeit und CO2-Konzentration kontrolliert. In Arabidopsis wird die Entwicklung und Strukturierung durch eine komplette MAP Kinasen Signalkaskade reguliert. Hingegen ist in höheren Pflanzen wenig über die CO2 induzierte Signalübertragung bei der Bewegung der Stomata bekannt. Experimente zeigten, dass hohe CO2 Konzentrationen eine schnelle und kurzzeitige Aktivierung von SIPK und NtMPK4 bewirken. Die Aktivierung der beiden MAP Kinasen könnte bei hoher CO2 Konzentration die Aktivierung eines Anionenkanals zur Stomata Bewegunng regulieren. Während in einer Vielzahl von Studien die antioxidativen Eigenschaften von Tocopherolen im Hinblick auf die Regulierung der Stresstoleranz beschrieben ist, sind die nicht-antioxidativen Eigenschaften von Tocopherolen in höheren Pflanzen bis heute nur wenig aufgeklärt. Daher wurde in Tabak die Funktion von α-Tocopherol auf die Stimuli-induzierte und MAP Kinasevermittelte Signalübertragung analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung der MAP Kinase durch die Behandlung mit einem pilzlichen Elizitor und dem Derivat α-Tocopherol- Phosphat induziert wird. Bei der Behandlung mit α-Tocopherol trat dieser Effekt nicht auf. Interessanterweise wurde bei α-Tocopherol im Gegensatz zu Ascorbinsäure ein kurzzeitiger inhibitorischer Effekt auf die Aktivierung der Stimuli-induzierten MAP Kinasen in BY2 Zellen und Tabakpflanzen beobachtet. Der Inhibitor-Aktivitäts-Test ließ vermuten, dass die Applikation indirekt die Aktivität von MAP Kinasen beeinflussen könnte. Diese Ergebnisse deuten auf eine negative Regulierung von α-Tocopherol auf die Stimuli-induzierte Signalübertragung durch Inaktivierung der MAP kinasen hin. Purin-Analoga sind aufgrund ihrer strukturellen Selektivität als spezifische Proteinkinase- Inhibitoren in Mammalia beschrieben. In dieser Arbeit wurden C2, N6, N9 –trisubstituierte Purine getestet, um grundlegende Beziehungen zwischen chemischer Struktur und inhibitorischen Effekten auf pflanzliche MAP Kinasen zu untersuchen. Die Modifikation der Substitution in der Position C2 und N9 bedingte eine erhöhte inhibitorische Aktivität von 6- (Benzylamino)-Purin Analoga. Daneben lassen die 6-(iso-Pentenylamino)-Purin Analoga vermuten, dass die Addition einer Methylgruppe an der N9 Position verglichen mit der Addition einer Isopropyl-Gruppe eine um das zweifache erhöhte inhibitorische Aktivität bewirkt. Zusammengefasst zeigen die Studien, dass die Selektivität und Wirksamkeit der Inhibitioren durch die Modifikation der chemischen Struktur verbessert wird. Desweiteren wurde die physiologische Funktion von AtPDP1 (Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1) auf die Regulation der Abwehrsignalübertragung, hervorgerufen durch biotsche und abiotische Faktoren, charakterisiert. Interessanterweise bewirkte die Überexpression von AtPDP1 eine erhöhte Empfindlichkeit gegen virulente Pathogene und nekrotrophe Pilze. Zudem begünstigte es die Bildung von Nekrosen aufgrund von unbekannten biotischen Faktoren. Dagegen zeigten diese überexprimierenden Linien während erhöhtem Salzstress eine signifikante Verzögerung der Seneszenz und eine höhere Quantenausbeute des PS II im Vergleich zu den Kontrollpflanzen. Die Ergebnisse weisen sehr deutlich auf eine positive Regulation von AtPDP1 auf die Salztoleranz und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber biotischem Stress hin. Daher wird angenommen, dass AtPDP1 durch komplexe Signalwege und Wechselwirkungen während der Stressadaptation reguliert wird.Activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases is a common reaction of plant cells in defense-related signal transduction pathways. Since the downstream events after the activation of MAP kinases are largely unknown in plants, the role of MAP kinases in the co-ordinate regulation of defense reactions and primary carbon metabolism by stress related stimuli has been analyzed in tomato. Thus, the relationship between mitogen activated protein kinases (LpMPK2 and LpMPK3) and extracellular invertases Lin6, as the key enzyme of an apoplasmic phloem unloading pathway, has been analyzed. The results showed that the mRNAs of LpMPK3 and Lin6 are sequentially induced by the same set of stress related stimuli (E-Fol, PGA,wounding, and KCl). The induction of the Lin6 promotor, as revealed by an increase in β-glucuronidase activity after 2 hours, was dependent both on the expression and activation of LpMPK3. These data suggest that the induction of extracellular invertase Lin6 by stress related stimuli requires LpMPK3. Glucose, metabolic molecule, was shown to result in the simultaneous induction of AtMPK4 and AtMPK6 activities that could be separated by anion-exchange chromatography, and characterized by differential cross-reaction with MAP kinase antibodies. Taken together, these data suggest that the activation of MAP inases play central roles in the regulation of sugar signaling. Stomatal movement is controlled by environmental signals including light intensity,humidity and atmospheric CO2 level. In Arabidopsis, a complete MAP kinase signaling cascade regulates stomatal development and patterning. However, the movement of stomata mediated by CO2 induced signaling pathways is not fully studied in higher plants. Here, we show that elevated levels of CO2 induce rapid and transient activation of SIPK and NtMPK4. The activation of both MAP kinases may regulate the anion channel activation for stomatal movement by the elevated level CO2. Up to now, the non-antioxidant function of tocopherol is not clear in higher plant,whereas the ability of tocopherol to modulate the stress tolerance mediated by function of antioxidant has been described in numerous studies. Thus, the function of α-tocopherol in stimuli-induced signal transduction pathways mediated by MAP kinase has been analyzed in tobacco. It has been shown that the activation of MAP kinase was induced by treatment of fungal elicitor and α-tocopherol phosphate but not α-tocopherol. Interestingly, α-tocopherol showed the transient inhibitory effect on the activation of stimuli-induced MAP Kinases in BY2 cells and tobacco plants, whereas ascorbate did not inhibit the activation of MAP kinases. The inhibitory activity test indicated that current application may indirectly affect the activity of MAP kinases. These results suggest that α-tocopherol can negatively regulate stimuliinduced signal transduction pathways via inactivation of MAP kinases. The purine-analogues have been tested and reported to be specific inhibitors of protein kinases mediated by structural-based selectivity in mammalian. Here, we tested C2, N6, N9-trisubstituted purines to determine basic relationship between their chemical structure and inhibitory activity using a particular plant MAP kinase. The modification of substitution in position C2 and N9 caused the increased inhibitory activity of 6-(benzylamino) purine analogue. In addition, 6-(isopentenylamino) purine analogues suggested that addition of a methyl group to position N9 caused at least 2-fold increased inhibitory activity compared with the addition of isopropyl group.Taken together, our study suggests that the selectivity and potency of inhibitors can be improved by structure modification. In addition, we have characterized the physiological function of Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1 (AtPDP1) in modulating the interaction of defense pathways mediated by biotic and abiotic factors. Interestingly, overexpression of AtPDP1 resulted in increasing susceptibility of virulent pathogens and necrotrophic fungus, and developing necrosis induced by unknown biotic factors. However, these overexperssion lines showed the significantly delayed senescence and higher level of phosystem II quantum yield compared with control plants against high salt stress. Our results strongly indicate that AtPDP1 positively regulate with salt tolerance, and enhances the sensitivity to biotic stresses. We propose that the AtPDP1 might be regulated with the complex pathways of interplay among various signaling during stress adaptation