Thérapie génique ex vivo pour les β-hémoglobinopathies et les maladies métaboliques

Monogenic disorder are inherited mutation(s) in a single gene that result in abnormal protein synthesis impairing normal cellular homeostasis and organ function that reduces patient life-pan. Recently autologous transplantation of genetically corrected patient's hematopoietic stem cells (HSCs) defined as ex-vivo gene therapy (GT) has emerged as a promising curative approach for such genetic diseases. In ex-vivo GT, targeted integration of a therapeutic transgene into a tolerant and safe locus appears to be a powerful approach to produce the therapeutic protein above physiological level in a broad type of hematopoietic cells using endogenous promoter. Such genome editing strategy relies on DNA double strand break and delivery of a functional copy of the mutated gene in the locus of interest. Here, we exploited the α-globin locus (HBA) as a safe harbor locus for transgene integration to develop a universal platform for expression and secretion of therapeutic proteins into erythroid cells. In HSCs, we induced double strand breaks (DSBs) in HBA locus with CRISPR-Cas9 and delivered a therapeutic transgene using AAV-6 to target integration by homology directed repair. Due to the abundance of erythroid cells in human (5X10^6 RBCs/microliter of blood) and the high HBA expression in erythroid population (around 1,5g/day), the HBA platform would require minimal transgene integration events in HBA locus to provide sufficient amount of therapeutic proteins reducing as consequence the potential off-target and toxicity due to editing and DNA donor delivery. First, we applied the HBA platform for β-thalassemia : a genetic condition impairing the hemoglobin formation and triggering toxic α-globin chain precipitation. The genetic correction of β-thalassemia using our HBA platform results in 1 copy of A-globin gene deletion decreasing the α-globin chain precipitation while α-globin gene integration into HBA locus restore the normal hemoglobin formation. Then, we evaluated the HBA platform for erythroid-specific secretion of therapeutic proteins into bloodstream and, in particular,we focused on a genetic metabolic disorder: lysosomal acid lipase (LAL) deficiency caused by LIPA gene mutation(s) that lead to toxic lipid accumulation especially in liver. We achieved efficient expression and secretion of LAL enzyme that retained enzymatic activity and cross-corrected the lipid accumulation in patients' fibroblasts. We then focused on the optimization of LIPA cDNA transgene using lentiviral vectors (LVVs) to maximize the LAL expression and secretion. The optimized LIPA transgene will serve for LVV-based ex-vivo GT and for our HBA targeted platform in the purpose of enhancing the LAL expression while minimizing the targeting integration events required to fully correct the disorder. Finally, to better characterize LAL-D phenotype and to evaluate the therapeutic potency of our GT strategy, we set-up a multimodal cytometry approach using flow cytometry and image flow cytometry. We evaluated this pipeline on mainly patient's fibroblasts and on peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMCs) for LAL-D mouse model.Les maladies monogéniques sont des mutations héréditaires d'un seul gène qui entraînent une synthèse anormale de protéines, altérant l'homéostasie cellulaire normale et la fonction des organes et réduisant la durée de vie des patients. Récemment, la greffe autologue de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) de patients génétiquement corrigés appelée thérapie génique (TG) ex-vivo, est apparue comme une approche curative prometteuse pour ces maladies. Dans la TG ex-vivo, l'intégration ciblée d'un transgène thérapeutique dans un locus tolérant apparaît comme une approche puissante pour produire les protéines thérapeutiques à un niveau supérieur au niveau physiologique dans un large type de cellules hématopoïétiques en utilisant un promoteur endogène. Une telle stratégie d'édition du génome repose sur la cassure double brin d'ADN et la livraison d'une copie fonctionnelle du gène muté dans le locus d'intérêt. Ici, nous avons exploité le locus de l'α-globine (HBA) comme un locus tolérant pour l'intégration de transgènes afin de développer une plateforme universelle pour l'expression et la sécrétion de protéines thérapeutiques par les globules rouges (GR). Dans les HSCs, nous avons induit des cassures double brin dans le locus HBA avec CRISPR-Cas9 et délivré un transgène thérapeutique en utilisant un AAV-6 pour cibler l'intégration par réparation dirigée par l'homologie. En raison de l'abondance des globules rouges chez l'homme (5X10^6 globules rouges/microlitre de sang) et de la forte expression de HBA dans cette population (environ 1,5g/jour), la plateforme HBA nécessiterait un minimum d'événement d'intégration du transgène pour fournir une quantité suffisante de protéines thérapeutiques, réduisant ainsi les risques de toxicité et d'édition non spécifique induit par CRISPR-Cas9 ou l'AAV6. Dans un premier temps, nous avons appliqué la plateforme HBA à la β-thalassémie : une condition génétique altérant la formation de l'hémoglobine (composé de 2 α-globine et 2 β-globine) et déclenchant la précipitation toxique de la chaîne α-globine. La correction génétique de la β-thalassémie à l'aide de notre plateforme HBA entraîne la délétion d'une copie du gène de l'α-globine, ce qui diminue la précipitation de cette chaîne, tandis que l'intégration du gène de la β-globine dans le locus HBA rétablit la formation normale d'hémoglobine. Ensuite, nous avons évalué la plateforme HBA pour la sécrétion spécifique de protéines thérapeutiques par les GRs dans la circulation sanguine et, en particulier, nous nous sommes concentrés sur un trouble métabolique génétique : la déficience en lipase acide lysosomale (LAL) causée par une ou plusieurs mutations du gène LIPA qui entraînent une accumulation toxique de lipides, notamment dans le foie. Nous avons obtenu une expression et une sécrétion efficaces de l'enzyme LAL qui a conservé son activité enzymatique et corrigé l'accumulation de lipides dans les fibroblastes des patients. Nous nous sommes ensuite concentrés sur l'optimisation du transgène LIPA en utilisant des vecteurs lentiviraux (LVVs) pour maximiser l'expression et la sécrétion de la LAL. Le transgène LIPA optimisé servira à développer une TG ex-vivo basée sur les LVVs et à notre plateforme ciblée HBA dans le but d'améliorer l'expression de LAL tout en minimisant les événements d'intégration nécessaires pour corriger complètement la maladie. Enfin, pour mieux caractériser le phénotype la déficience en LAL et évaluer le pouvoir thérapeutique de notre stratégie de GT, nous avons mis en place une approche de cytométrie multimodale utilisant la cytométrie en flux et la cytométrie en flux d'images. Nous avons évalué ces techniques principalement sur les fibroblastes du patient et sur les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMCs) provenant de souris déficiente en LAL