La cinétique de différentiation des cellules souches hématopoïétiques uniques après transplantation : l´état d´équilibre et l´effet de la cytokine érythropoïétine

Hematopoietic cells are the most numerous cells in our body, and their overall short half-life requires their steady production. At the apex of the hematopoietic system resides a small number of hematopoietic stem cells (HSC) which give rise to all mature hematopoietic cell types through self-renewal and differentiation divisions. For long it was assumed that these HSC are a homogeneous population of multipotent cells. Technical advancements, which allowed to trace HSC at the single cell level, revealed however that single HSC behave differently with respect to the number of lineages and the relative amounts of different lineages they produce and are heterogeneous with respect to their long-term engraftment capacity. Notably different lineage restricted and biased cells, as well as cells with long-term and short-term engraftment potential have been identified in the HSC gate. One technique allowing the lineage tracing of single HSC is cellular barcoding, which relies on the introduction of an artificially created DNA fragment, the barcode, in the genome of HSCs through viral transfection. As these barcodes are transmitted to all daughter cells, the analysis of the barcode identity of progeny cells reveals which lineages and how much of each is produced by each individual HSCs.In this thesis we used a new cellular barcoding library to analyze how the different HSC subsets previously described interact and behave in the first six weeks after bulk transplantation, as well as the influence of erythropoietin (EPO) on this process. More in detail, we described the reconstitution kinetics of HSC in the myeloid (M; macrophage, monocytes, neutrophils, eosinophils), lymphoid (B-cells), dendritic cells, megakaryocyte and erythroid lineage (E; erythroblasts) at the single cell level. For the analysis of HSC differentiation towards the erythroid lineage we established the detection of cellular barcodes from RNA. We discovered that HSC clonal succession and clonal stability co-occur in the first weeks after transplantation, but are not evenly distributed over the different hematopoietic lineages. Notably the production of erythroid cells 2-weeks after transplantation was maintained by distinct short-lived HSC clones, while high myeloid cell production after transplantation was guaranteed by long-lived multi-outcome HSCs. In vitro EPO exposure of HSC before transplantation, did not change the overall lineage output of transplanted HSC, or HSC differentiation kinetics, lineage restrictions, and biases at the single cell level in the first six weeks after transplantation. However, after transplantation of EPO-exposed HSC long-lived unbiased multi-outcome HSCs lost preponderance with respect to cellular output. Rather, changing clones of two types of highly biased HSCs, myeloid-erythroid (ME)-biased and myeloid B-cell (MB)-biased HSC, produced now the majority (>60%) of erythroid, myeloid and B-cells. This effect was transient but stable over different EPO concentrations and after in vivo EPO treatment during transplantation. It suggests a functional compensation mechanism at work.We hope the detailed description of the engraftment kinetics of single control and EPO-exposed HSC after bulk transplantation will have relevance both for fundamental research and the clinics.La majorité des cellules de notre corps sont des cellules hématopoïétiques. Un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques produit toutes ces cellules par divisions de maintenance and différentiation. Il a longtemps été considéré que ces cellules souches étaient une population homogène et que chaque cellule produit le même nombre et type de cellule hématopoïétique mature. Cette idée a été réfutée quand il est devenu possible de suivre la différentiation de cellules uniques. Ainsi les cellules hématopoïétiques souches individuelles produisent différents types et quantités relatives de cellules hématopoïétiques matures, amenant la reconstitution après transplantation des cellules souches peut être hétérogène. Quelques cellules qui expriment les marqueurs de cellules souche hématopoïétique survivent uniquement pour une courte durée après transplantation, d’autres pour des années.Dans cette thèse, nous avons utilisé la technique de traçage de lignée des codes-barres cellulaires pour comprendre comment les différents types de cellules souches hématopoïétiques se comportent dans les six premières semaines après transplantation et l’influence de la cytokine érythropoïétine sur ce processus. Les codes-barres cellulaires sont des fragments artificiels d’ADN qui sont introduit dans les cellules souches hématopoïétiques murines par transfection virale. Après transplantation de cellules souche hématopoïétique barcodées de cette manière, chaque division cellulaire va transmettre le code-barre aux cellules filles. Par l’analyse des codes-barres dans les cellules hématopoïétiques matures on peut ainsi comprendre quels types et quelles quantités relatives de cellules matures les cellules souches hématopoïétiques ont produites. Nous avons observé que certaines cellules souches contribuaient de manière stable dans les premières semaines après transplantation, ainsi qu’une succession clonale. Des différences au niveau de la production de différents types de cellules hématopoïétiques matures a aussi été observées. Les globules rouges sont produits par des clones de vie courte et les cellules myéloïdes par des clones stables sur 6 semaines. Le traitement des cellules souches hématopoïétiques avec l’érythropoïétine avant leur transplantation, ne change pas ces phénomènes généraux. Cependant en réponse à l’érythropoïétine, deux types de clones deviennent prépondérants : des clones produisant beaucoup plus de globules rouges et myéloïdes que lymphoïdes, et des clones produisant beaucoup de cellules lymphoïdes et myéloïdes et très peu de globules rouges, suggérant une compensation clonale entre les cellules souches hématopoïétiques. Cet effet était transitoire et disparaît 4 mois après transplantation. Cet effet est dose dépendant en fonction de la concentration d’érythropoïétine.Nous espérons que l’étude détaillée de la différentiation de cellules souches hématopoïétiques uniques wt ou traitées avec l’érythropoïétine après transplantation ait un impact pour notre compréhension pour l’hématopoïèse fondamentale, mais aussi pour des applications cliniques. L’érythropoïétine est utilisée couramment comme médicament. La description détaillée de son effet sur les cellules souches hématopoïétiques est importante pour garantir la sécurité de telles utilisations. De plus, elle peut aider à comprendre les principes généraux de l’actions de cytokines sur les cellules souches hématopoïétiques. La transplantation de cellules souches est utilisée comme traitement dans de nombreuses pathologies. Une phase importante pour le succès d’une transplantation sont les premières semaines quand les niveaux de cellules sanguines ne sont pas encore normalisés. Comprendre quelles cellules produisent quels types de cellules dans cette phase peut servir de base pour le développement de nouvelles stratégies pour raccourcir cette phase critique pour le patien