Vers la génération de cellules corticosurrénales à partir de cellules souches pluripotentes

The adrenal cortex (AC) is a central steroidogenic organ with key functions in maintaining body homeostasis. Several adrenal diseases (eg Congenital adrenal hyperplasia (CAH)) could in principle be repaired by correcting the mutation (e.g. via recombination) or introduction of a transgene carrying a wildtype form of the mutated gene to permanently restore enzyme activity. However, data from our and other groups demonstrate a rapid turnover of the adrenal cortex. Thus, steroidogenic cells that have been genetically modified are likely to be rapidly replaced by amplifying progenitors that may still carry the mutation. Genetic correction will therefore need to target adrenal stem cell (ASC) populations rather than fully differentiated steroidogenic cells, and in vitro seems to be the better approach. In principle two alternative routes could be envisaged: 1) Generation of induced pluripotent cells (IPSC) from a patient, correction of the mutation using a CRISPR/Cas9 approach and subsequent differentiation towards the adrenal lineage with transplantation in/under the patient's adrenal capsule. 2) Isolation and culture of ASCs, correction in vitro followed by transplantation back into the patient. Aim of this project is to establish a protocol for the in vitro differentiation of mouse ES cells (mESCs) into adrenal progenitor cells and to evaluate their suitability for transplantations under the adrenal capsule. To achieve this goal, I decided to develop a stepwise differentiation procedure that follows as much as possible normal development. The adreno-gonadal primordium (AGP) develops at the interface of the anterior intermediate and lateral plate mesoderm. I developed a robust protocol that allows in vitro differentiation of mESCs via the EpiSC and primitive streak state, into the anterior intermediate and lateral plate mesoderm. Proper differentiation was demonstrated by the expression of cell type specific markers including Brachyury (T) for the primitive streak, Osr1, Gata4 and WT1 for mesodermal lineage, LIM1 and PAX2 for the anterior intermediate, and Foxf1 with Prrx1 for lateral plate mesoderm. The pathways underlying the specification of steroidogenic organs are not yet well established. To obtain further insight into this process, we established a collaboration with Prof. Serge Nef (University of Geneva), whose laboratory has performed single cell RNA-Seq experiments at critical time points of adreno-gonadal differentiation and separation of the adreno-gonadal primordium (AGP) into adrenal primordium (AP) and gonadal primordium (GP). Using information extracted from this cell atlas, and by testing various pathway activators and inhibitors, I was able to further orient differentiation towards the early steroidogenic fate as demonstrated by the upregulation of Nr5a1, a master regulator of steroidogenesis. By testing a range of extracellular matrix proteins, I could show that fibronectin 1 (FN1) enhanced the production of NR5A1 positive cells. Moreover, induction of the PKA pathway using a cAMP derivative (8-Br-cAMP) further increased NR5A1 expression levels in these conditions, both at the RNA and protein level; but still in limiting numbers to claim high efficiency of the protocol. In addition, culturing cells in 3D induced Nr5a1 and other early adrenal progenitor markers over gonadal ones in specific conditions. Further investigation for key aspects of the in vitro differentiation is needed to establish a robust adrenal organoid protocol. Finally, I could partially translate the protocol to hIPSCs, in which the cells were fated correctly for the early steroidogenic progenitor lineage. Taken together these results provide a road map for differentiation of pluripotent stem cells into adrenal progenitors and will form the basis for future work towards transplantation therapies of adrenal diseases.A corticosurrénale(CS)est un organe central stéroïdogénique qui joue un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie de l'organisme. Plusieurs maladies des surrénales(par exemple l'hyperplasie congénitale des surrénales(HCS))pourraient en principe être réparées en corrigeant la mutation (par exemple par recombinaison) ou en introduisant un transgène portant une forme sauvage du gène muté pour restaurer de façon permanente l'activité enzymatique. Les données de notre groupe et d'autres groupes démontrent un renouvellement rapide du cortex surrénalien. Ainsi, les cellules stéroïdogéniques(CSG) qui ont été génétiquement modifiées sont susceptibles d'être rapidement remplacées par amplification des progéniteurs pouvant encore porter la mutation. La correction génétique devra donc cibler les populations de cellules souches surrénaliennes(CSS)plutôt que les CSGs entièrement différenciées, et l'approche in vitro semble être la meilleure. En principe, deux voies alternatives pourraient être envisagées :1) Génération de IPSC à partir d'un patient, correction de la mutation et différenciation ultérieure vers la lignée surrénalienne avec transplantation dans la surrénalienne du patient.2) Isolement et culture de CSS, correction in vitro suivie d'une transplantation chez le patient. Le but de ce projet est d'établir un protocole pour la différenciation in vitro de cellules ES de souris(mESCs)en cellules progénitrices surrénaliennes.Pour atteindre cet objectif, j'ai décidé de développer une procédure de différenciation par étapes qui suit autant que possible le développement normal. Le primordium adréno-gonadique(AGP)se développe à l'interface du mésoderme intermédiaire antérieur et du mésoderme latéral. J'ai développé un protocole robuste qui permet la différenciation in vitro de mESC via l'état EpiSC et l'état de ligne primitive, en mésoderme intermédiaire antérieur et latéral. Une différenciation correcte a été démontrée par l'expression de marqueurs spécifiques du type cellulaire, notamment T pour la ligne primitive, Osr1, LIM1, PAX2, Foxf1, Prrx1 et WT1 pour la lignée du mésoderme. Les voies de signalisation qui sous-tendent la spécification des organes stéroïdogéniques ne sont pas encore bien établies. Pour mieux comprendre ce processus, nous avons établi une collaboration avec le professeur Serge Nef(Université de Genève),dont le laboratoire a réalisé des expériences RNA-Seq sur cellules uniques à des moments clé de la différenciation adréno-gonadique et de la séparation du AGP en AP et GP. En utilisant les informations extraites de cet atlas cellulaire, et en testant divers activateurs et inhibiteurs de voies, j'ai pu orienter davantage la différenciation vers le destin stéroïdogénique précoce, comme le démontre la régulation à la hausse de Nr5a1, un régulateur principal de la stéroïdogénèse. En testant une série de protéines de la matrice extracellulaire, j'ai pu montrer que la FN1 augmentait la production de cellules positives NR5A1. L'induction de la voie PKA a d’avantage augmenté les niveaux d'expression de NR5A1 dans ces conditions, tant au niveau de l'ARN que de la protéine ; mais toujours en nombre limité pour revendiquer une grande efficacité de protocole. En outre, la culture des cellules en 3D a induit Nr5a1 et d'autres marqueurs précoces de progéniteurs surrénaliens par rapport aux marqueurs gonadiques dans des conditions spécifiques. Des recherches supplémentaires sur les aspects clés de la différenciation in vitro sont nécessaires pour établir un protocole robuste d'organoïdes surrénaliens. Enfin, j'ai pu partiellement transposer le protocole aux hIPSC, dans lesquelles les cellules étaient correctement destinées à la lignée des progéniteurs stéroïdogéniques précoces. L'ensemble de ces résultats fournit une feuille de route pour la différenciation des cellules souches pluripotentes en progéniteurs surrénaliens et constituera la base de futurs travaux sur les thérapies de transplantation des maladies surrénaliennes