Modélisation du syndrome néphrotique en utilisant des organoïdes rénaux dérivés de cellules iPS

Le syndrome néphrotique cortico-résistant (SNCR) est une maladie rénale rare caractérisée par une protéinurie massive due à des altérations structurelles de la barrière de filtration glomérulaire, dont le podocyte est un composant majeur. Plus de 50 gènes ont été impliqués dans les formes monogéniques de SNCR, tous exprimés dans le podocyte. Parmi eux, NPHS2, codant pour la podocine, a été identifié par le groupe du Pr. Antignac comme responsable de SNCR sévère précoce ; la mutation p.R138Q de le podocine étant la plus répandue dans la population européenne. Bien que le SRNS se présente principalement sous forme isolée, il peut également être associé à des manifestations extra-rénales. Ainsi, le groupe du Pr. Antignac a récemment décrypté les bases génétiques du syndrome de Galloway-Mowat (GAMOS), associant le SRNS à une microcéphalie et des troubles neurologiques, dont les mécanismes pathologiques restent encore mal compris. Le premier objectif de ma thèse de doctorat a été de mettre en place les techniques et outils adéquats pour utiliser les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans la modélisation in vitro de ces maladies. Deuxièmement, je me suis concentrée sur leur utilisation afin de déchiffrer les mécanismes cellulaires et moléculaires pathologiques impliqués dans les formes isolées et systémiques (néphro-cérébrales) des troubles glomérulaires héréditaires. Nous avons obtenu des cellules d'un patient atteint de SRNS portant la mutation homozygote R138Q de la podocine, ainsi que des cellules de patients atteints de GAMOS. Ainsi, j'ai mis en place la différenciation des iPSC en organoïdes rénaux. Ceux-ci possèdent les mêmes caractéristiques que les néphrons in vivo, à savoir la succession ordonnée des segments du néphron. Au niveau du glomérule, j'ai confirmé l'expression et la localisation de marqueurs clés des podocytes, tels que WT1 au noyau, la podocalyxine à la surface apico-latérale et au pôle basal la néphrine, la podocine et la synaptopodine ; de même que leur identité podocytaire par analyse transcriptomique. L'emploi des organoïdes rénaux représente la pierre angulaire de cette étude. J'ai démontré que les organoïdes arborant la mutation de la podocine R138Q ont un niveau d'expression inférieur et une localisation subcellulaire altérée de la podocine R138Q. Lors de la correction générée par CRISPR/Cas9 des iPSC de patient, nous avons restauré la localisation et le bon niveau d'expression de la podocine. De plus, j'ai étudié le profil transcriptomique des podocytes triés par FACS afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires en jeu. De manière inattendue, les données RNA-Seq suggèrent l'implication d'une activation de la réponse de type interféron dans les podocytes du patient R138Q. Des analyses supplémentaires sont désormais nécessaires pour statuer entre un effet de mutation ou l'influence dû au fond génétique du patient.Grâce aux iPSC il est possible de modéliser les aspects rénaux et neuronaux du GAMOS. Des organoïdes rénaux et des progéniteurs neuronaux dérivés d'iPSC ont été utilisés dans ce travail. Nous avons observé une perturbation des processus cellulaires fondamentaux tels que la prolifération, la survie et une augmentation de l'apoptose dans les deux systèmes. Ceux-ci confirment nos données récemment publiées sur des lignées de podocytes. Cela serait la conséquence d'une diminution dans l'efficacité et fidélité de traduction protéique, due à un défaut de synthèse de la modification universelle t6A des ARNt décodant les codons ANN. Cette nouvelle approche basée sur iPSC nous a permis de mettre en évidence des phénotypes cellulaires liés à des maladies rénales héréditaires dans de types cellulaires pertinents et un contexte spécifique au patient. Bien que certaines limites persistent et que la technique puisse encore être améliorée, les iPSC représentent actuellement un système complémentaire qui est en train d'être mis en place au laboratoire pour d'autres sujets de recherche.Steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS) is a rare renal disease characterized by massive proteinuria due to structural alterations of the glomerular filtration barrier, of which the podocyte is a major component. Over 50 genes have been implicated in monogenic forms of SRNS, all relevantly expressed in the podocyte. Among them, the NPHS2 gene, encoding podocin, has been identified by Pr. Antignac's group as causative of severe early-onset SRNS with the podocin p.R138Q mutation being the most prevalent mutation in the European population. Although SRNS mostly occurs as an isolated glomerular disorder, it may also be associated with extra-renal manifestations. In particular, Pr. Antignac's group recently elucidated the genetic basis of Galloway-Mowat syndrome (GAMOS), associating SRNS with microcephaly and neurological impairment. While several causative genes have been linked to GAMOS, pathological mechanisms underlying this disease are still poorly understood. Kidney organoids differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) have recently emerged as powerful tools for in vitro renal disease modeling. The first aim of my PhD thesis has been to set up the suitable techniques and tools to employ iPSCs in disease modeling. Secondly, I focused on their use to decipher the pathological cellular and molecular mechanisms implicated in both isolated and systemic (nephro-cerebral) forms of hereditary glomerular disorders. We obtained cells from SRNS patient bearing the R138Q podocin mutation in the homozygous state, as well as cells from GAMOS patients. Thus, I set up the differentiation of patient-derived iPSCs into kidney organoids which possess the same features of in vivo nephrons, namely ordered structural development of nephron segments. Glomeruli contain polarized octopus-shaped podocytes extending cellular protrusions at their base. I confirmed the expression and localization of key podocyte markers, such as nuclear WT1, podocalyxin at the apico-lateral surface and basal nephrin, podocin and synaptopodin, as well as their podocyte identity by transcriptomic analysis. iPSC-derived kidney organoids represent the milestone of this study, extensively employed to compare patient- and healthy control-derived podocytes. I demonstrated, by differentiating podocin R138Q iPSCs into organoids that these latter display lower expression level and altered subcellular localization of R138Q podocin, with diffuse perinuclear staining. Upon CRISPR/Cas9-mediated correction of patient iPSCs, we succeeded in rescuing the proper podocin localization and expression level. Moreover, I investigated the transcriptomic profile of FACS-sorted podocytes to gain insights into the molecular mechanisms underlying the disease. Unexpectedly, RNA-Seq data suggest implication of an interferon-like response activation in R138Q patient podocytes, although further analyses are needed to discriminate between a mutation effect or the influence of the patient genetic background. Since iPSCs offer the possibility to model both renal and neural aspects of GAMOS, iPSC-derived kidney organoids and late cortical progenitor cells have then been employed in this work. We observed a perturbation of fundamental cell processes such as proliferation and survival, pointing to an increase in apoptosis in both systems. Such defects, which confirm our recently published data on podocyte cell lines, are likely to be consequent to reduced efficiency and fidelity in protein translation due to the deficient synthesis of the universal t6A modification of ANN-decoding tRNAs. This new iPSC-based approach allowed us to highlight cellular phenotypes linked to hereditary kidney diseases on relevant cell types, podocytes and/or neural cells and in a patient-specific context. Although some limitations still persist and the technique can be further improved, iPSCs currently represent a complementary system that is being set up in the laboratory for other research subjects