The formation of an apoplastic diffusion barrier in Arabidopsis seeds is regulated by peptide hormone signaling

Diffusion barrier formation is a critical factor in plant development. The most well described diffusion barriers in Arabidopsis are the Casparian strip and the cuticle. They function in the formation of organ boundaries, prevent water and molecule loss, and protect the plant against environmental stresses. The Casparian strip surrounds the root vascular tissue, whereas the cuticle covers aerial plant organs and is formed de novo during seed development. Embryonic cuticle formation is regulated by a peptide hormone signaling pathway, involving the leucine rich repeat receptor like kinases GASSHO1 (GSO1), GASSHO2 (GSO2) (Tsuwamoto et al. 2008) and the subtilisin-like serine protease ABNORMAL LEAF SHAPE 1 (ALE1). Whereas the latter pathway components have been identified in 2001 and 2008, the peptide hormone mediating the signaling has remained elusive. One aim of this work was to identify the missing pathway element. It was hypothesized that the peptide hormone is released from a larger precursor by ALE1 protease activity to trigger cuticle formation via interaction with the GSO receptors. To uncover the unknown element, the signaling pathway for Casparian strip formation, prooved to be a useful lead. Remarkably, Casparian strip and embryonic cuticle formation employ the same receptor (GSO1), and for Casparian strip formation the GSO1 ligands are known to be members of the CASPARIAN STRIP INTEGRITY FACTOR (CIF) protein family (Doblas et al. 2017, Nakayama et al. 2017). Based on its similarity to the mature CIF peptides and on its phenotypic appearance, it was speculated that a seed expressed protein, called TWISTED SEED1 (TWS1), could serve as the sought ALE1 substrate. As it can be challenging to link proteases to their physiological substrates, this work describes methods how to identify protease specific cleavage sites. One of them was applied to test if TWS1 serves as ALE1 substrate. GFP-tagged TWS1 was transiently coexpressed with ALE1 in Nicotiana benthamiana via agroinfiltration. An ALE1-specific TWS1 cleavage product was detected in the protein extract of coinfiltrated leaves. It was identified by pull down via GFP immunoprecipitation, subsequent separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and mass spectrometry (MS) analysis. Another method, described in this work, is the identification of protease cleavage sites by in-gel reductive dimethylation: cleavage product-containing gel bands are treated with formaldehyde and cyanoborohydride, prior to in-gel tryptic digest, to achieve a dimethylation of N-terminal free amino groups. The chemically modified N-termini can rapidly be identified and assigned to previous cleavage by the protease of interest. With the method described above, it was found that TWS1 is c-terminally cleaved by ALE1. The two amino acids directly flanking the cleavage site were found to be important for ALE1 cleavage site selection, as their substitution caused a loss of ALE1- dependent cleavage. Our cooperation partners demonstrated an interaction of mature TWS1 with the GSO receptors. The binding affinity of mature TWS1 was reduced by a 3 amino acid C-terminal extension, demonstrating the biological relevance of ALE1-mediated TWS1 processing. Like the CIFs, TWS1 contains a DY tyrosine sulfation motive at its N-terminal processing site. The role of tyrosine sulfation in precursor processing is largely unexplored and was addressed in this work by comparing in-vitro cleavage of different sulfated versus nonsulfated TWS1 precursors. SBT1.8 was found to cleave TWS1 at the N-terminal processing site, and cleavage site selection was influenced by the sulfation state of TWS1 P2´ tyrosine. A homology based 3D model of SBT1.8 was created, which suggested that SBT1.8 interacts with the negatively charged sulfate via a positively charged arginine residue (R302). The role of R302 in substrate binding and recognition was confirmed by in-vitro cleavage assays with mutated SBT1.8 versions, in which R302 was replaced. N-terminal TWS1 cleavage was no longer observed when R302 was substituted. Likewise, no N-terminal cleavage was observed for two other seed expressed Arabidopsis subtilases (SBT1.1 and SBT5.4) that feature an arginine at the corresponding position, indicating that the sole presence of R302 is not sufficient for N terminal cleavage site recognition.Die Bildung von Diffusionsbarrieren ist ein entscheidender Faktor in der Entwicklung von Pflanzen. Die am besten beschriebenen Diffusionsbarrieren in Arabidopsis sind der Caspary-Streifen und die Cuticula. Sie dienen der Abgrenzung von Organen, verhindern den Verlust von Wasser und Molekülen und schützen die Pflanze vor umweltbedingtem Stress. Der Caspary-Streifen umgibt das vaskuläre Gewebe der Wurzel, wohingegen die Cuticula oberirdische Pflanzenorgane bedeckt und während der Samenentwicklung de novo gebildet wird. Die Bildung der embryonalen Cuticula wird von einem Peptidhormon Signalweg reguliert, in dem die Leucin-reichen Rezeptor-ähnlichen Kinasen GASSHO1 (GSO1), GASSHO2 (GSO2) (Tsuwamoto et al. 2008) und die Subtilisin-ähnliche Serinprotease ABNORMAL LEAF SHAPE 1 (ALE1) involviert sind. Während letztere bereits 2001 und 2008 identifiziert wurden, blieb das Signal-vermittelnde Peptidhormon schwer zu fassen. Ein Ziel dieser Arbeit war es, dieses letzte Element des Signalwegs zu identifizieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Peptidhormon von einem größeren Vorläufer durch ALE1 Protease Aktivität freigesetzt wird und durch eine Interaktion mit den GSO Rezeptoren die Bildung der Cuticula auslöst. Um das unbekannte Element aufzudecken erwies sich der Signalweg zur Bildung des Caspary-Streifens als nützlicher Anhaltspunkt. Beachtenswerter Weise wird zur Bildung des Caspary-Streifens und der embryonalen Cuticula der gleiche Rezeptor (GSO1) eingesetzt und es war bekannt, dass die GSO1 Liganden zur Bildung des Caspary-Streifens zur Familie der CASPARIAN STRIP INTEGRITY FACTOR (CIF) Proteine gehören (Doblas et al. 2017, Nakayama et al. 2017). Aufgrund seiner Ähnlichkeit zu den reifen CIF Peptiden und seines loss-of-function Phänotyps wurde spekuliert, dass TWISTED SEED1 (TWS1) als das gesuchte ALE1 Substrat im Samen dienen könnte. Um den oft schwierigen Nachweis einer Verbindung von Proteasen mit ihren physiologischen Substraten zu führen, beschreibt diese Arbeit Methoden zur Identifizierung von Protease-spezifischen Spaltstellen. Eine davon wurde angewendet um zu testen, ob TWS1 als ALE1 Substrat dient. GFP markiertes TWS1 wurde transient mit ALE1 in Nicotiana benthamiana coexprimiert. Im Proteinextrakt der coinfiltrierten Blätter wurde ein ALE1-spezifisches TWS1 Spaltprodukt detektiert. Es wurde durch Pulldown via GFP Immunpräzipitation, anschließende Auftrennung durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und massenspektrometrische Analyse identifiziert. Eine weitere in dieser Arbeit beschriebene Methode ist die Identifizierung von Protease-Spaltstellen durch in-Gel reduzierende Dimethylierung: Spaltprodukt enthaltende Gelbanden werden vor tryptischem in-Gel Verdau mit Formaldehyd und Cyanoborhydrid behandelt, um eine Dimethylierung der freien N-terminalen Aminogruppen zu erzielen. Die chemisch modifizierten N-Termini können schnell identifiziert und einer vorhergehenden Spaltung durch die zu untersuchende Protease zugeordnet werden. Mit der oben beschriebenen Methode wurde gezeigt, dass TWS1 C-terminal von ALE1 gespalten wird. Die beiden Aminosäuren, die die Spaltstelle direkt flankieren, sind für die Erkennung wichtig, da deren Austausch zu einem Ausbleiben der ALE1-abhängigen Spaltung führt. Unsere Kooperationspartner haben eine Interaktion von reifem TWS1 mit den GSO Rezeptoren nachgewiesen, wobei die Bindungsaffinität des reifen TWS1 durch eine C-terminale Extension um 3 Aminosäuren reduziert wurde, was die biologische Relevanz der ALE1-vermittelten TWS1 Prozessierung darlegt. Wie die CIFs enthält TWS1 an seiner N-terminalen Prozessierungsstelle ein DY Tyrosin-Sulfatierungs Motiv. Die Rolle von Tyrosin-Sulfatierung in der Prozessierung von Vorläufern ist weitgehend unerforscht und wurde in dieser Arbeit durch das Vergleichen von in-vitro Spaltungen verschiedener sulfatierter mit nicht sulfatierten TWS1 Vorläufern untersucht. Es wurde gezeigt, dass die im Samen exprimierte Protease SBT1.8 TWS1 N-terminal prozessiert und, dass die Selektion der SBT1.8 Spaltstelle durch den Sulfatierungszustand von TWS1 P2´ Tyrosin beeinflusst wird. Ein Homologiemodell von SBT1.8 wies darauf hin, dass ein positiv geladener Argininrest (R302) mit dem negativ geladenen Sulfat interagiert. Die Bedeutung von R302 für Bindung und Erkennung des Substrates wurde durch in-vitro Spaltversuche mit mutierten SBT1.8 Varianten, in denen R302 ersetzt wurde, bestätigt. N-terminale TWS1 Spaltung wurde nach Austausch von R302 nicht mehr beobachtet. Für zwei weitere im Samen exprimierte Arabidopsis Subtilasen (SBT1.1 und SBT5.4) mit Arginin an entsprechender Position wurde auch keine N-terminale Spaltung beobachtet, was darauf hinweist, dass R302 für die Erkennung der N-terminalen Spaltstelle nicht allein verantwortlich ist