Macrophage polarization by apoptotic cancer cells - a RNAi high-throughput screen and validation of interleukin 10 regulation

Tumor-associated macrophages (TAM) are a major supportive component within neoplasms and by their plasticity promote all phases of tumor development. Mechanisms of macrophage (M Phi) attraction and differentiation to a tumor-promoting phenotype, defined among others by distinct cytokine patterns such as pronounced immunosuppressive interleukin 10 (IL-10) production, are largely unknown. However, a high apoptosis index within tumors and strong M Phi infiltration correlate with poor prognosis. Thus, I aimed at identifying signaling pathways contributing to generation of TAM-like M Phi by using supernatant of apoptotic cancer cells (ACM) as stimulus. To distinguish novel factors involved in generating TAM-like M Phi, I used an adenoviral RNAi-based approach. The primary read-out was production of IL-10. However, mediators modulating IL-10 were re-validated for their impact on regulation of the cytokines IL-6, IL-8 and IL-12. Following assay development, optimization and down-scaling to a 384-well format, primary human M Phi were transduced with 8495 constructs of the adenoviral shRNA SilenceSelect® library of Galapagos BV, followed by activation to a TAM-like phenotype using ACM. I identified 96 genes involved in IL-10 production in response to ACM and observed a pronounced cluster of 22 targets regulating IL-10 and IL-6. Principal validation of five targets of the IL-10/IL-6 cluster was performed using siRNA or pharmacological inhibitors. Among those, IL-4 receptor-alpha and cannabinoid receptor 2 were confirmed as regulators of IL-10 and IL-6 secretion. One protein identified in the screen, the nerve growth factor (NGF) receptor TRKA was chosen for in-depth validation, based on its involvement in IL-10, IL-6 and IL-12 secretion from ACM-stimulated human M Phi. TRKA possesses a cardinal role in neuronal development, but compelling evidence emerges suggesting participation of TRKA in cancer development. First experiments using pharmacological inhibitors principally confirmed the involvement of TRKA in IL-10 secretion by ACM-stimulated M Phi and revealed PI3K/AKT and to a lesser extend MAPK p38 as important signaling molecules downstream of TRKA activation. Signaling through TRKA required the presence of its ligand NGF, as indicated by NGF neutralization experiments. NGF was not induced by or present in ACM, but was constitutively secreted by M Phi. Interestingly, M Phi responded to authentic NGF with neither AKT and p38 phosphorylation nor IL-10 production. TRKA is well known to be transactivated by other receptors and in neurons its cellular localization is decisive for its function. Inhibitors of common transactivation partners did not influence IL-10 production by human M Phi. Rather, ACM-treatment provoked pronounced translocation of TRKA to the plasma membrane within 10 minutes as observed by immunofluorescence staining. Consequently, I was intrigued to clarify mechanisms of TRKA trafficking in response to ACM. The bioactive lipid sphingosine-1-phosphate (S1P) has been previously identified as important apoptotic cell-derived mediator involved in TAM-like M Phi polarization. Indeed, I observed S1P and src kinase involvement in ACM-mediated IL-10 induction. Furthermore, inhibition of S1P receptor (S1PR) signaling or src kinase activity prevented TRKA translocation, whereas a TRKA inhibitor or anti-NGF did not block TRKA trafficking to the plasma membrane in response to ACM. Thus, autocrine secreted NGF activated TRKA to promote IL-10 secretion, which required previous S1PR/src-dependent translocation of TRKA to the plasma membrane. Following the detailed analysis of IL-10 regulation, I was interested whether other TAM phenotype markers were influenced by ACM and whether their expression was regulated through TRKA-dependent signaling. Five of six markers were up-regulated on mRNA level by ACM, and secretion of IL-6, IL-8 and TNF-alpha was triggered. S1PR-signaling was essential for induction of all but one marker, whereas TRKA signaling was only required for cytokine secretion. Interestingly, none of the investigated TAM markers was regulated identically to IL-10, emphasizing a tight and exclusive regulation machinery of this potent immunosuppressive cytokine. Finally, I aimed to validate the in vitro findings in human ACM-stimulated M Phi. Therefore, I isolated murine TAM as well as other major mononuclear phagocyte populations from primary oncogene-induced breast cancer tissue. Indeed, TRKA-dependent signaling was required for spontaneous cytokine production selectively by primary murine TAM. Besides IL-10, the TRKA pathway was decisive for secretion of IL-6, TNF-alpha and monocyte chemotactic protein-1, indicating its relevance in cancer-associated inflammation. In summary, my findings highlight a fine-tuned regulatory system of S1P-dependent TRKA trafficking and autocrine NGF signaling in TAM biology. Both factors, S1P as well as NGF, might be interesting targets for future cancer therapy.Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM) begünstigen verschiedene Phasen der Tumorentwicklung. Bisher ist das Wissen über die Mechanismen der Rekrutierung und Differenzierung von Makrophagen (M Phi) zu TAM, die sich unter anderem durch eine usgeprägte Produktion von immunsuppressivem Interleukin 10 (IL-10) auszeichnen, unvollkommen. Eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der M Phi-Infiltration sowie der Zelltotrate innerhalb von Tumoren und einer schlechten Prognose für Krebspatienten wurde berichtet. Auf Grundlage dessen, untersuchte ich in der vorliegenden Arbeit Signalwege, die zur Entstehung von TAM-ähnlichen M Phi führen. Dazu stimulierte ich humane primäre M Phi mit Überständen von apoptotischen Tumorzellen (ACM). Zuerst führte ich ein RNAi-basiertes adenovirales Hochdurchsatzverfahren (HTS) zur Identifizierung unbekannter Faktoren, die zur Entstehung von TAM-ähnlichen M Phi beitragen, durch. Als primären Endpunkt analysierte ich zunächst die Produktion von IL-10. Die identifizierten IL-10-regulierenden Faktoren wurden im nächsten Schritt auf ihre Beteiligung an der Synthese von weiteren tumorfördernden (IL-6, IL-8) und tumorinhibierenden (IL-12) Zytokinen getestet. M Phi wurden mit 8495 adenovirale shRNAs der SilenceSelect® Bibliothek der Firma Galapagos BV transduziert und mit ACM zu TAM-ähnlichen M Phi polarisiert. 96 Gene, die eine Rolle in der ACM-vermittelten IL-10 Produktion spielen, wurden identifiziert. Davon zeigten 22 Gene eine bisher nicht beobachtete Koregulation von IL-10 und IL-6 auf. Fünf Kandidaten aus dieser Gruppe wurden mit Hilfe von Inhibitoren oder siRNA validiert und eine Beteiligung des IL-4 Rezeptors alpha sowie des Cannabinoid Rezeptors 2 an der IL-10 und IL-6 Regulation konnte bestätigt werden. In darauffolgenden Versuchen verifizierte ich im Detail die Beteiligung des nerve growth factor (NGF) Rezeptors TRKA an der Ausbildung TAM-ähnlicher M Phi nach ACM-Behandlung. Die Ausschaltung des Gens im HTS hatte zu einer verminderten Sekretion von IL-10 und IL-6 sowie einer Zunahme von IL-12 geführt. TRKA ist essentiell an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt und neuere Berichte weisen auf seine Beteiligung in der Tumorbiologie hin. Pharmakologische Inhibitoren bestätigten die Notwendigkeit von TRKA an der ACM-vermittelten IL-10 Produktion, sowie die TRKA-abhängige Aktivierung der Signalmoleküle PI3K/AKT und, wenn auch weniger ausgeprägt, MAPK p38. Die Neutralisation von NGF demonstrierte, dass von M Phi konstitutiv autokrin sezerniertes NGF für die IL-10 Sekretion benötigt wurde. Synthetisches NGF zeigte jedoch keinen Effekt auf die AKT und p38 Phosphorylierung oder auf die Produktion von IL-10. Interessanterweise legten Immunfluoreszenzaufnahmen von ACM-stimulierten M Phi eine deutliche Zunahme von TRKA an der Plasmamembran nach 10-minütiger Simulation offen, die durch Inhibition von TRKA oder Neutralisation von NGF nicht beeinflusst wurde. Dieses Phänomen war Anlass für weiterführende Studien. Sphingosine-1-Phosphat (S1P) wurde im Vorfeld als wichtiger Mediator in der ACMvermittelten M Phi Polarisierung identifiziert und ich konnte eine Abhängigkeit der IL-10 Produktion von S1P und Src Kinasen zeigen. Des Weiteren wurde die Anreicherung von TRKA an der Plasmamembran durch Inhibitoren von Src sowie S1P Rezeptoren verhindert. Diese Daten indizieren eine komplexe Regulation der ACM-vermittelten IL-10 Produktion in primären M Phi. S1P, generiert von apoptotischen Krebszellen, vermittelt S1P Rezeptor- und Src Kinasen-abhängig die Translokalisation von TRKA an die Zelloberfläche von M Phi. Der Rezeptor wird daraufhin von autokrin sezerniertem NGF aktiviert und initiiert darauffolgend die Produktion von IL-10. In einem weiteren Schritt untersuchte ich zusätzliche biologische Marker, die eine Rolle bei der Funktion von TAM spielen. ACM bewirkte eine starke Sekretion von IL-6, IL-8 und TNF-alpha, sowie eine Hochregulation weiterer Marker auf mRNA-Ebene. Die S1P Rezeptoraktivität war für nahezu alle Marker essentiell. Die Zytokinsekretion war ebenfalls abhängig von TRKA, jedoch wurde keiner der untersuchten Faktoren analog zu IL-10 reguliert. Diese Befunde unterstreichen die fein abgestimmte und exklusive Regulation dieses hochpotenten immunsuppressiven Zytokins. Um meine in vitro Daten zu bestärken, isolierte ich TAM und weitere mononukleare Phagozytenpopulationen aus primärem Onkogen-induzierten Brustkrebsgewebe der Maus und untersuchte die spontane Zytokinproduktion dieser Zellen. Auch in diesem Modell zeigte sich eine, auf TAM beschränkte, TRKA-abhängige Produktion von IL-10, IL-6, TNF-alpha und monocyte chemotactic protein-1, und die Rolle von TRKA im Tumor-assoziierten Entzündungsgeschehen wurde bekräftigt. Zusammenfassend konnte ich Mechanismen der S1P- und NGF-abhängigen TRKA Signaltransduktion und deren Funktion im Bezug auf Makrophagen im Tumorgeschehen identifizieren. Sowohl S1P als auch NGF stellen somit interessante Zielmoleküle in der künftigen Krebstherapie dar