Rolle von endothelialen Cytochrom-P450-Epoxygenasen in der Regulation der Angiogenese

Cytochrome P450 epoxygenases of the 2C family (CYP2C) are highly expressed in the endothelium and metabolize arachidonic acid to different regioisomers of epoxyeicosatrienoic acids (EET). They have a number of roles in the regulation of vascular tone and homeostasis by activating different signal transduction pathways and have recently been reported to be involved in proliferation and angiogenesis. However, the exact mechanisms by which epoxygenases regulate angiogenesis are still unclear. Therefore, the initial aim of the present study was to characterize the relevance of major signalling molecules that are involved in angiogenesis and to investigate possible signalling pathways involved. Initially the effect of CYP2C9 overexpression on expression levels of EphB4, a tyrosine kinase that plays a role in a number of developmental processes, was investigated. EphB4 protein expression was increased in CYP2C9 overexpressing cells without any effects on expression levels of its ligand ephrinB2. To clarify whether EphB4 is a critical determinant of CYP2C9-induced angiogenesis, endothelial cell sprouting was assessed using a collagen gel-based in vitro angiogenesis assay. Following transfection with EphB4 antisense or scrambled oligonucleotides, capillary-like structures were clearly present after 24 hours in cells overexpressing CYP2C9, while EphB4 downregulation abolished CYP2C9-induced sprouting. In addition stimulation of human umbilical vein endothelial cells with VEGF resulted in an increase in CYP2C expression and a subsequent increase of 11,12-EET production; an effect that was abolished by the CYP epoxygenases inhibitor MSPPOH as well as when cells were infected with a dominant negative mutant of AMPK. In vivo 11,12-EET treatment increased EphB4 expression in mesenteric arteries as well as in Matrigel plugs; an effect that was abolished when plugs were impregnated at the same time with small interfering RNA (siRNA) for EphB4. Furthermore, impregnation of Matrigel plugs with VEGF resulted in endothelial cell and smooth muscle cell recruitment into a Matrigel plug and this effect was mediated by CYP2C9-derived EETs as it was prevented by 14,15-EEZE. When infiltration of EET impregnated plugs with endothelial cells and pericytes/smooth muscle cells in vivo was compared to the effects seen in VEGF treated plugs, it was apparent that only EET treatment resulted in the formation of tube like structures that were covered by smooth muscle cells. Therefore, the final aim of the study was to further define the consequences of EET signalling in vivo as well as to characterize its physiological relevance. This hypothesis could be assessed by isolectin injection through the tail-vein where isolectin was taken up only by the EET-impregnated plug. Moreover ultrasound measurements revealed accumulation of contrast agent in EET impregnated plugs compared to control plugs. Taken together our findings emphasize that CYP2C plays a crucial role in the vessel formation process by modulating the effects mediated by two important control elements of the angiogenic response, namely VEGF and EphB4. CYP2C-derived EETs not only participate as second messengers in the angiogenic response, but have the potential to influence much more than angiogenesis by enhancing smooth muscle cell/pericyte recruitment to endothelial cell tubes to promote vascular maturation.Im nativen Endothel exprimierte Cytochrom P450 Epoxygenasen der 2C Familie (CYP2C) synthetisieren aus Arachidonsäure verschiedene Regioisomere der Epoxyeicosatriensäure (EET), welche eine wichtige Rolle bei der Regulation des vaskulären Tonus und der Homöostase spielen. Obwohl schon beschrieben wurde, dass Enzyme der CYP2C Familie an Prozessen der Proliferation und Angiogenese beteiligt sind, ist der genaue molekulare Mechanismus ihrer Wirkung noch weitestgehend ungeklärt. Deswegen war das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit die Identifizierung von Signaltransduktionsmolekülen, die an der CYP-induzierten Angiogenese beteiligt sind, sowie die nachfolgende Charakterisierung möglicher daran beteiligten Signaltransduktionskaskaden. Zunächst wurde der Einfluss von CYP2C9 auf die Expression von EphB4, einer für eine Reihe von Entwicklungsprozessen wichtigen Tyrosinkinase, untersucht. In CYP2C9-überexprimierenden Zellen war die EphB4-Proteinexpression erhöht ohne einen Einfluss auf die Expression des Liganden ephrinB2 zu haben. Dieser Effekt war EET-vermittelt und konnte durch den CYP Epoxygenase Inhibitor MSPPOH, den PI3K Inhibitor LY 294002 oder gleichzeitige Transfektion mit einer dominant negativen Akt Mutante aufgehoben werden. Des weiteren führte die Stimulation von Zellen humaner Nabelschnurvenen mit VEGF sowohl zu einer Steigerung der CYP2C-Expression als auch zur vermehrten 11,12-EET Bildung; ein Effekt, der sowohl durch den Epoxygenase Inhibitor MSPPOH als auch durch gleichzeitige Infektion der Zellen mit einer dominant negativen Mutante der AMPK hemmbar war. Darüber hinaus sollte die physiologische Bedeutung dieser in vitro Befunde in vivo weiter konkretisiert werden und die Relevanz für den Angiogeneseprozess erörtert werden. Ein entscheidender Schritt für die Blutgefässbildung ist die Proliferation und Differenzierung von Endothelzellen, was zur Bildung von vaskulären röhrenartigen Gebilden (engl. „Tubes“) führt. Es konnte gezeigt werden, dass CYP2C an der VEGF-, nicht aber an der bFGF-vermittelten Ausbildung dieser Strukturen beteiligt ist, da der EET-Antagonist 14,15-EEZE beispielsweise in bFGF-behandelten Zellen keinerlei Effekt hatte. Auch in vivo führte die Imprägnierung eines Matrigel Plugs mit VEGF zur Wachstumsfaktor-spezifischen Rekrutierung von Endothel- als und in geringerem Ausmass auch zur Rekrutierung von glatten Muskelzellen bzw. Perizyten. Des weitern sollte der Einfluss von EETs auf die Reifung von Gefässen untersucht werden. Die Einwanderung von Endothelzellen und Pericyten/glatten Muskelzellen in vivo in einen EET-impregnierten Plug war vergleichbar mit der in VEGF-behandelte Plugs. Aber nur die EET-Behandlung führte zur Ausbildung von vaskulären „Tubes“, die auch mit glatten Muskelzellen verkleidet waren. Ebenso wurde durch die Schwanzvene von Mäusen injiziertes Isolektin nur durch die EET-impregnierten Plugs, nicht aber durch VEGF-imprägnierte Plugs aufgenommen. Weiterhin konnte durch Ultraschallmessungen ein erhöhtes Anfluten von Kontrastmittel im EET-behandelten Plug im Vergleich zur Kontrolle verzeichnet werden, was ein weiterer Hinweis für die Ausbildung von perfundierten, funktionsfähigen Gefässstrukturen ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass EETs über die Modulation zweier wichtiger Stellglieder der angiogenen Antwort, nämlich VEGF und EphB4, eine Rolle bei der Regulation von Rezeptoren und Signaltransduktionsmolekülen spielen, die essentiell für die normale Blutgefässentwicklung und Gefässreifung sind. Die von CYP2C-stammenden EETs sind nicht nur als sekundäre Botenstoff an der angiogenen Antwort, die durch eine Vielzahl von Faktoren ausgelöst wird, beteiligt, sondern haben zudem das Potential sowohl Endothelzellen als auch Perizyten/glatte Muskelzellen z