Entwicklung von Methoden für die immunhämatologische Diagnostik (gel card und solid phase) bei Patienten während der Behandlung mit dem therapeutischen Antikörper Daratumumab

Antibodies directed against the CD38 antigen like daratumumab (DARA), were developed for the treatment of multiple myeloma. Unfortunately, these antibodies interfere with pretransfusional laboratory testing. Red blood cells (RBCs) as well as multiple myeloma cells express CD38, which leads to panreactive results in the indirect antiglobulin test (IAT) if serum or plasma from DARA-treated patients is screened for alloantibody against RBCs. As a result, specific RBC alloantibody cannot reliably be identified before red cell transfusion, and this increases the risk for hemolytic transfusion reactions. This important safety issue for RBC transfusions led us to search for a method for patients´ diagnostics, which is easy to perform and does not cause transfusion delay. To overcome interference of DARA with pretransfusion compatibility testing I have investigated two approaches: i) DARA adsorption from patient plasma using CD38 expressing cells, ii) blocking the binding site of DARA on RBCs without influencing the binding of transfusion relevant RBC alloantibody. For the first approach, I have studied peripheral blood cells, which are easily available from a blood donation center, for their CD38 surface expression. PBMCs were shown to have the highest expression level and were tested as adsorption matrix to deplete free DARA from DARA-spiked plasma. After three consecutive adsorption steps agglutination strength in the IAT became weaker but could not be completely inhibited. Considering the conditions of a routine immunohematology laboratory this approach was not feasible for patients´ diagnostics because of limited patient plasma volume and because of the delay to transfusion caused by the time-consuming adsorption steps. For the second approach I generated F(ab’)2 fragments of DARA using pepsin digestion. Experiments using DARA-spiked plasma with and without red cell alloantibody and plasma from randomly selected patients with multiple myeloma before and after DARA infusion were performed in presence and absence of DARA F(ab’)2 fragments in the IAT. Preincubation of RBCs with DARA F(ab‘)2 fragments prevented DARA induced RBC agglutinations up to DARA concentrations found in patients´ plasma. I tested the method for two IAT methods widely used in routine immunohematology laboratories (microcolumn gel card and Capture®). I showed that the sensitivity to detect RBC alloantibody using the gel card and Capture® method was not influenced by addition of DARA F(ab’)2 fragments. The use of F(ab‘)2 fragments is a promising tool to resolve the interference of daratumumab with blood compatibility testing in the IAT. This approach may be more generally applicable to other therapeutic antibodies interfering with blood compatibility testing.Therapeutische Antikörper können unerwartete Wirkungen verursachen, wenn das Zielantigen nicht nur auf den Zielzellen exprimiert wird. Ein gegen das CD38-Antigen gerichteter Antikörper, Daratumumab (DARA), wurde für die Behandlung des multiplen Myeloms entwickelt. Allerdings beeinträchtigt dieser Antikörper erheblich die Verträglichkeitsuntersuchungen zwischen Blutkonserve und Patientenplasma vor der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten. CD38 wird auch auf Erythrozyten (RBCs) exprimiert. Durch die Bindung von DARA an die Spendererythrozyten wird im indirekten Antihumanglobulintest (IAT) eine in vitro Unverträglichkeit mit allen Testerythrozyten angezeigt. Dies wird dadurch verursacht, dass das erforderliche Antihumanglubulin (AHG) humanes IgG bindet, unabhängig davon, welches Zielantigen dieser Antikörper hat. Infolgedessen können Agglutinationen durch transfusionsrelevante Antikörper im Patientenplasma von DARA-induzieretn Agglutinationen nicht unterschieden werden, wodurch das Risiko für akute hämolytische Transfusionsreaktionen steigt. Daraus ergab sich die Fragestellung für meine Arbeit – eine Modifikation für den IAT zu finden, der diese Interferenz auflöst. Ich habe zwei neue Strategien verfolgt: i) die Adsorption von DARA aus dem Patientenplasma mit CD38-exprimierenden peripheren Blutzellen, ii) die Blockung der DARA-Bindungsstelle auf Erythrozyten, ohne dass die Bindung von transfusionsrelevanten erythrozytären Antikörpern behindert wird. Für den ersten Ansatz konnte ich PBMCs als die Zellen identifizieren, die die höchste CD38 Expression zeigten. Leider konnte die Inkubation von DARA-gespiktem Plasma selbst nach mehreren Adsorptionsschritten die Interferenz im IAT nicht vollständig beseitigen. Auch die Durchführung der Methode erwies sich als nicht praktikabel für ein Routine-Diagnostiklabor. Für den zweiten Ansatz habe ich mit Hilfe von Pepsin F(ab‘)2 Fragmente von DARA hergestellt um damit die DARA-Bindungsstelle auf den Erythrozyten zu blockieren, damit das AHG nur an gebundene transfusionsrelevante Antikörper bindet. Die Zugabe von DARA F(ab´)2 Fragmenten zu den Testerythrozyten konnte die DARA-induzierten Agglutinationen im IAT verhindern und im Plasma vorhandene erythrozytäre Alloantikörper sichtbar und differenzierbar machen. Weiterhin konnte ich nachweisen, dass die Zugabe von DARA (Fab´)2 Fragmenten nicht die Sensitivität der Teste im Gelzentrifugationstest und im Capture® beeinträchtigt. Experimente mit Plasma von Myelom-Patienten vor und nach der DARA-Infusion bestätigten die Ergebnisse. Die Verwendung von F(ab‘)2 Fragmenten ist ein vielversprechendes Verfahren, um Interferenzen von therapeutischen Antikörpern im IAT der prätransfusionellen Diagnostik aufzulösen - nicht nur für Daratumumab