POTENCIAL TERAPÊUTICO DO FÁRMACO BUPARLISIB NA LEUCEMIA MIELÓIDE CRÓNICA: Papel na resistência ao Imatinib

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe presence of the BCR-ABL fusion gene distinguishes Chronic Myeloid Leukaemia (CML) from other myeloproliferative neoplasms. This gene encodes the BCR-ABL1 oncoprotein, which has dysregulated tyrosine kinase activity and is the disease's primary therapeutic target. As a result, tyrosine kinase inhibitor imatinib is used as first-line therapy in CML. However, some patients develop resistance to this therapeutic strategy, so it is becoming increasingly important and extremely useful in clinical practice to identify new therapeutic targets that can be presented as alternatives for the treatment of patients with resistance, such as Buparlisib (BKM-120), an inhibitor of the PI3K cellular pathway, which is hyperactivated in CML.Thus, the aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of Buparlisib, both alone and in combination with Imatinib, in in vitro models of CML sensitive and resistant to Imatinib.In this regard, the sensitive (K-562) and resistant (K-562 RC and K-562 RD) cell lines were incubated for 72 hours in the absence and presence of increasing doses of BKM-120, and metabolic activity was analysed using the resazurin metabolic assay. The therapeutic potential of two monotherapy administration regimens (single and fractionated dose) and a therapeutic combination regimen with Imatinib were evaluated. The cell cycle was evaluated using flow cytometry and propidium iodide (PI)/RNase staining. By double staining cells with annexin V and 7-aminoactinomycin D (7-AAD), flow cytometry was also used to determine the type of cell death. Using May Grünwald-Giemsa staining, optical microscopy was used to analyse morphology and cell death. The data was statistically analysed with a significance level of 95%.Buparlisib reduced metabolic activity in a time- and dose-dependent manner, according to the results of single drug administration. After 72 hours of incubation, the IC50 of K-562 in this assay was 1.08 M, 1.18 M for K-562 RC, and 1.04 M for K-562 RD. After studying fractional administration, it was possible to conclude that it is a good therapeutic strategy in the resistant cell lines, as metabolic activity values were significantly lower than those of single administration. Buparlisib in combination with Imatinib has also been shown to have a significant impact on lowering metabolic activity when compared to the drugs alone, regardless of cell line.Furthermore, BKM-120 significantly increased cell death, primarily inducing apoptosis. BKM-120 also had a cytostatic effect, blocking cells in the G2/M phase in addition to its cytotoxic effect.As a result, we can conclude that Buparlisib is an effective therapeutic agent, particularly when administered in a fractionated regime and in combination with Imatinib, and that it may represent a promising therapeutic approach in the treatment of Chronic Myeloid Leukaemia.A Leucemia Mieloide Crónica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa que se distingue pela presença do gene de fusão BCR-ABL. Esse gene codifica a oncoproteína BCR-ABL1, que possui atividade tirosina cinase desregulada e é o principal alvo terapêutico dessa doença. Assim sendo, o Imatinib, um inibidor da tirosina cinase, é usado como terapêutica de primeira linha na LMC. No entanto, alguns doentes desenvolvem resistência a esta estratégia terapêutica e, assim sendo, é cada vez mais importante e extremamente útil na prática clínica identificar novos alvos terapêuticos que se possam apresentar como alternativas para o tratamento de doentes com resistência, como o caso do Buparlisib (BKM-120), um inibidor da via celular PI3K, que se encontra hiperativada na LMC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico do Buparlisib, em monoterapia e em associação terapêutica com o Imatinib, em modelos in vitro de LMC sensíveis e resistentes ao Imatinib.Neste sentido, as linhas celulares sensíveis (K-562) e resistentes (K-562 RC e K-562 RD) foram incubadas durante 72 horas na ausência e presença de doses crescentes de BKM-120 e o ensaio metabólico de resazurina foi usado para analisar a atividade metabólica. Avaliou-se o potencial terapêutico de dois esquemas de administração em monoterapia (toma única e fracionada) e um esquema de combinação terapêutica com o Imatinib. A citometria de fluxo foi usada para avaliar o ciclo celular usando a marcação com iodeto de propídio (PI)/RNase. Recorreu-se também à citometria de fluxo para avaliar o tipo de morte celular através da marcação das células com anexina V e 7-aminoactinomicina D (7-AAD). A microscopia de ótica foi usada para analisar a morfologia e a morte celular usando a coloração de May Grünwald-Giemsa. Os dados foram analisados estatisticamente, considerando-se um nível de significância de 95%.Os resultados do estudo da administração única do fármaco mostraram que o Buparlisib reduziu a atividade metabólica de forma dependente do tempo e da dose. Neste ensaio, após 72 horas de incubação, o IC50 das K-562 foi de 1,08 µM, 1,18 µM para as K-562 RC e 1,04 µM para as K-562 RD. Após o estudo da administração fracionada, foi possível entender que esta é uma boa estratégia terapêutica nas três linhas celulares, na medida em que os valores de atividade metabólica foram muito inferiores aos da administração única. A associação de Buparlisib com Imatinib também demonstrou ter um impacto significativo na redução da atividade metabólica comparativamente aos fármacos em monoterapia, independentemente da linha celular.Além disso, o BKM-120 aumentou significativamente a morte celular, induzindo maioritariamente morte celular por apoptose. Além do efeito citotóxico, o BKM-120 induziu também efeito citostático, bloqueando as células na fase G2/M.Assim, podemos concluir que o Buparlisib é um agente terapêutico eficaz, principalmente quando administrado em regime fracionado e em associação com o Imatinib, podendo representar uma boa abordagem terapêutica no tratamento da Leucemia Mielóide Crónica