Molecular monitoring of patients with chronic myeloid leukemia treated with imatinib mesylate and evaluation of treatment resistance mechanisms: mutation of BCR-ABL and expression of MDR1 and BCRP genes

A leucemia mielóide crônica (LMC) é caracterizada pela translocação (9;22) que dá origem ao gene quimérico BCR-ABL. Este gene codifica uma proteína com atividade tirosina quinase, p210, constitutivamente ativa. O três mecanismos envolvidos na patogênese da LMC são o aumento da proliferação celular, alteração da adesão celular ao estroma e matriz medular e inibição da apoptose. A introdução do mesilato de imatinibe (MI), um inibidor de tirosina quinase, revolucionou o tratamento da LMC levando pacientes em fase crônica a remissões duráveis, porém uma parcela destes não responde ou perde a resposta ao longo do tratamento. Os mecanismos de resistência ao MI podem ser classificados como independentes de BCR-ABL (a1- glicoproteína ácida e genes de resistência a múltiplas drogas) ou dependentes de BCR-ABL (superexpressão de BCR-ABL e mutações do domínio quinase do gene ABL). Objetivo: avaliar a presença de mutações no domínio quinase do gene ABL e a expressão dos genes de resistência a múltiplas drogas MDR1 e BCRP em amostras pré-tratamento com MI, acompanhar estes pacientes mensalmente através da quantificação de transcritos BCR-ABL e quando ocorrer resistência reavaliar a presença de mutações do domínio quinase do ABL e a expressão dos genes de resistência a múltiplas drogas. Material e Métodos: Foram avaliados 61 pacientes com LMC em fase crônica. A pesquisa de mutações do domínio quinase foi realizada pela técnica de seqüenciamento direto e a expressão relativa dos genes de resistência a múltiplas drogas foi avaliada por PCR em tempo real. A quantificação absoluta do número de transcritos BCR-ABL foi realizada pela técnica de PCR em tempo real utilizando-se o sistema Taqman de sondas de hibridização. Resultados: Nas amostras pré-tratamento dos 61 pacientes estudados não foram detectadas mutações. Quando relacionamos o aumento da expressão dos genes MDR1 e BCRP à resposta citogenética completa aos 12 meses de tratamento não houve diferença estatística significativa (p>0,05). Quanto ao número de transcritos BCR-ABL, observamos que os pacientes que apresentaram menos de 1% pela escala internacional aos 3 meses de tratamento atingiram a RMM em período menor (7 meses) do que os que apresentaram mais de 1% (12 meses) com diferença estatística significativa (p = 0,03). Conclusões: As mutações do domínio quinase do gene BCR-ABL nas amostras pré-tratamento não foram detectadas ou pela sensibilidade da técnica de seqüenciamento direto (10%) ou porque tais mutações são mais freqüentes nas fases acelerada e blástica. A expressão dos genes de resistência a múltiplas drogas (MDR1) e BCRP) em pacientes com LMC-FC ao diagnóstico não apresentou correlação com o aparecimento de resistência secundária ao MI. Além disso a quantificação mensal dos transcritos BCR-ABL aos 3 meses pode ser considerada um marcador com valor prognóstico.Chronic myeloid leukemia is characterized by t(9;22) translocation. The chimeric gene BCR-ABL encodes a p210BCRABL protein with constitutive tyrosine kinase activity which is directly related to CML pathogenesis. The imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, is the first-choice treatment for patients in chronic phase but some patients show primary resistance or relapse after initial response. The mechanisms of resistance to the imatinib mesylate treatment are BCR-ABL dependent (amplification of BCR-ABL and mutation of kinase domain of BCR-ABL) or independent of BCR-ABL (1-acid glycoprotein and expression of multidrug resistance genes). Objective: The objective of this work was to evaluate the mechanisms of resistance (kinase domain mutation and MDR1 and BCRP genes expression) to imatinib mesylate in pretreatment samples, quantify of BCR-ABL transcript on a monthly follow up plan, and to re-evaluate the mechanisms of resistance in the absence or loss of treatment response. Patients and Methods: We have evaluated 61 pretreatment samples derived from chronic phase CML patients. The number of BCR-ABL transcripts was quantified by RTQ-PCR with taqman probes and MDR1 and BCRP expression were evaluated by RTQ-PCR with Syber Green. Mutations within the BCR-ABL kinase domain were screened by direct sequencing and we also have screened the T315I mutation in pretreatment samples by allele-specific PCR. Results:We detected no mutations in the 61 pretreatment samples. The correlation analysis between the expression of MDR1/BCRP genes and the cytogenetic response at 12 months of treatment revealed no significant statistical difference (p = > 0.05). The results of BCR-ABL quantification in the follow up of our cohort indicated that patients who had transcripts <1% by the international scale at 3 months of therapy are more likely to achieve rapid MMR (median of 7 months) than those who had >1% (median of 12 months) (p = 0,03). Conclusions: As expected, the kinase domain mutations of BCR-ABL in pretreatment samples of CML chronic phase patients are not detectable by direct sequencing because of the sensitivity of the assay (10%) and also because these mutations are more common in accelerated phase and blast crisis. About the expression of multidrug resistance genes MDR1 and BCRP, they showed no correlation with secondary resistance to imatinib mesylate. And finally the number of BCR-ABL transcripts at 3 months of treatment can be considered a marker with prognostic value