Bacillus megaterium: Produktion, Sekretion und Reinigung von rekombinanten Proteinen

In this thesis an alternative, competitive protein production and purification system was established using the Gram positive bacterium Bacillus megaterium. Therefore, a set of xylose-inducible gene expression vectors for the intracellular production of target proteins carrying combinations of N- and C-terminally fused His- and StrepII-affinity tags was constructed. These vectors were successfully tested using the green fluorescence protein (GFP) as model. Up to 18 mg GFP per l were produced in shaking flask cultures and were purified to apparent homogeneity by affinity chromatography. High cell density cultivation allowed upscaling of the procedure to 274 mg GFP per l. For the export of target proteins containing various combinations of N- and C-terminally fused His6- and StrepII-affinity tags into the growth medium, a second set of expression vectors was constructed. A Lactobacillus reuteri levansucrase served as model protein. The efficiency of a B. megaterium lipase (LipA), penicillin G acylase (PGA), and a computer designed leader peptide for SEC-dependent protein export were evaluated. Up to 4 mg levansucrase per l were exported into the growth medium. Coexpression of the signal peptidase gene sipM responsible for signal peptide removal increased the protein export. Deletion of the gene for the only detectable extracellular protease NprM stabilised exported proteins. Protocols for the purification of affinity-tagged exported proteins from the growth medium were developed. The alternative sucrose-inducible sacB promoter system was identified. This promoter was successfully applied for the high yield recombinant protein production and export. Finally, an expression system using two different, independently replicating plasmids was established and evaluated. The established system provides a useful alternative to the commonly used Escherichia coli systems. The majority of the developed vectors are commercialised by the MoBiTec GmbH (Göttingen, Germany).Im Rahmen dieser Arbeit ist ein Vektorsystem für die Produktion von rekombinanten Proteinen im Gram positiven Bakterium Bacillus megaterium etabliert worden, das eine Alternative zu herkömmlichen Escherichia coli Systemen bietet. Dafür wurden Expressionsvektoren entwickelt, die auf einem Xylose-induzierbaren Promotor basieren. Mit diesen Vektoren ist es nun möglich, rekombinante Proteine sowohl intra- als auch extrazellulär zu produzieren. Über diese Vektoren können Zielproteine sowohl C- als auch N-terminal mit His- oder StrepII-Affinitäts Tags fusioniert werden. Für die intrazelluläre Produktion wurde das System mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Modell getestet. Bis zu 18 mg GFP pro l Schüttelkolben-Kultivierung konnten produziert werden. Über Affinitätschromatographie war es möglich die Fusionsproteine erfolgreich zu reinigen. Eine Hochzelldichte-Kultivierung ermöglichte die Erhöhung der Menge an intrazellulär produziertem GFP auf bis zu 274 mg pro l. Die Produktion von extrazellulären rekombinanten Proteinen wurde mit der Levansucrase aus Lactobacillus reuteri als Modell untersucht. Den Export des heterologen Proteins vermittelten die Signalpeptide der B. megaterium eigenen Lipase A (LipA) und Penicillin G Acylase (PGA) sowie ein bioinformatisch konstruiertes Peptid. Bis zu 4 mg Levansucrase pro Liter wurden so ins Medium sekretiert. Weiterhin erhöhte die Koexpression des Signalpeptidase-Gens sipM, verantwortlich für die Prozessierung des Pro-Proteins, die extrazelluläre Konzentration. Die Deletion des Gens für die extrazelluläre Protease NprM führte zur Stabilisiserung des exportierten Proteins. Für die Reinigung der Fusionsproteine aus dem Medium wurden erfolgreich Protokolle entwickelt. Weiterhin wurde ein neues Saccharose-induzierbares Promotorsystem identifiziert und erfolgreich für die heterologe Proteinproduktion genutzt. Ein Zwei-Vektor System steht nun ebenfalls für die Produktion rekombinanter Proteine in B. megaterium bereit