Zielgerichtete genetische Weiterentwicklung von Bacillus megaterium für Anwendungen in der rekombinanten Proteinproduktion

The work presented in this thesis focused on the directed genetic optimisation of the Gram-positive bacterium Bacillus megaterium for recombinant protein production. For this purpose gene expression was systematically analysed and improved on transcriptional and translational level. A novel gene expression system was developed based on the highly processive RNA polymerase of the bacteriophage T7. Using this system, the green fluorescent protein (GFP) was successfully produced intracellularly to significant higher amounts (49.7 mg l-1) compared to the reference using the well-established xylose-inducible promoter system (7.2 mg l-1). Interestingly, the application of the T7 RNA polymerase dependent gene expression system for the secretory production of the exoenzyme levansucrase resulted in significantly lower protein yields possibly due to an overload of the secretion machinery and the subsequent induction of stress responses. Furthermore, a versatile codon test system was developed and individual codons were experimentally identified which are limiting the efficiency of the translational process in B. megaterium. The subsequent identification of a rare tRNA gene and its coexpression significantly elevated the rate of translation of corresponding codons into the respective polypeptide chain as estimated by the formation of the model protein GFP. First insights into the molecular basis for the development of natural competence in B. megaterium were obtained. Overproduction of the putative central transcription factor ComK for competence development resulted in partial cell lysis. Nevertheless, for the first time the ability of B. megaterium to develop a functional machinery for DNA-uptake and -integration was demonstrated. As a proof of concept two eukaryotic proteins of industrial importance, a human keratin-binding domain and a fungal hydrophobin, were produced with B. megaterium in cooperation with the BASF SE. Multiple parameters like codon usage optimisation, the nature of the signal peptide or the cultivation conditions were analysed in order to improve the yield in secretory production of the respective proteins. It was shown that intracellular aggregation and degradation severely hampered quantitative production of the keratin-binding domain. The fungal hydrophobin on the other hand could successfully be produced, secreted and purified to homogeneity and its surface active properties were demonstrated.Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Gram-positive Bakterium Bacillus megaterium gezielt für Anwendungen in der rekombinanten Proteinproduktion optimiert. Hierfür wurde der Prozess der rekombinanten Genexpression auf den Ebenen der Transkription und Translation analysiert und verbessert. Ein neuartiges T7 RNA Polymerase-basiertes Genexpressionssystem wurde für B. megaterium etabliert. Mit diesem System konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) erfolgreich intrazellulär produziert werde, wobei die Ausbeute um den Faktor 7 im Vergleich zum etablierten Xylose-induzierbaren Promotorsystem gesteigert werden konnte. Interessanterweise resultierte die vergleichende Produktion des heterologen Exoenzyms Levansucrase mit Hilfe des T7 RNA Polymerase basierten Genexpressionssystems in einer geringeren Proteinausbeute. Diese Beobachtung deutete auf eine mögliche Überlastung der Sekretionsmaschinerie und einer daraus resultierenden Stressantwort hin. Weiterhin wurde ein Codon-Testsystem etabliert, mit dessen Hilfe einzelne Codons experimentell identifiziert wurden, die die Translationseffizienz in B. megaterium limitieren. Die Coexpression einer seltenen tRNA konnte im Folgenden als Strategie zur Steigerung der Translationseffizienz genutzt werden. Zusätzlich konnten erste Einblicke in die molekularen Grundlagen einer möglichen Kompetenzentwicklung bei B. megaterium gewonnen werden. Überproduktion des zentralen putativen Transkriptionsfaktors zur Entwicklung der natürlichen genetischen Kompetenz resultierte in einer partiellen Zelllyse. Dennoch konnte zum ersten Mal die Fähigkeit von B. megaterium zur Ausbildung einer funktionellen DNA Transformationsmaschinerie aufgezeigt werden. In Kooperation mit der BASF SE wurden des Weiteren zwei industriell relevante Proteine von eukaryotischem Ursprung in B. megaterium produziert. Hierbei handelte es sich um eine Keratin-bindende Domäne und um ein Hydrophobin. Zahlreiche Parameter wie die Codon Usage Anpassung, die Wahl des Signalpeptids oder die Kultivierungsparameter wurden variiert, um eine hohe Ausbeute an sekretiertem Zielprotein zu erzielen. Jedoch zeigte sich, dass intrazelluläre Aggregation und Degradation der Keratin-bindenden Domäne einer quantitativen Produktion entgegenstanden. Das Hydrophobin hingegen konnte erfolgreich sekretorisch produziert, gereinigt und die oberflächenaktiven Eigenschaften evaluiert werden