Reproductive barriers in crop plants: understanding the genetic and molecular bases of self-incompatibility in olive and male-sterility in chicory

The thesis deals with the understanding of two reproductive barriers affecting crop plants: self-incompatibility in olive and male-sterility in chicory. Olive (Olea europaea L.) is one of the oldest agricultural tree crop species and, in spite of the great economical and cultural impact, a few studies have been carried out on its reproductive barriers. The aim of this research was to elucidate the self-incompatibility system in olive from cytohistological and bio-molecular standpoints. Self-incompatibility is one of the most effective systems adopted by flowering plants to prevent inbreeding, maintaining so diversity within the species. Olive is currently classified as a gametophytic self-incompatible (GSI) plant because of distinctive morphological traits, as wet-type pistil and bi-nucleated pollen. However, detailed cytological analyses of more than 34,000 pollen grains performed using pistils of self-compatible and self-incompatible cultivars under self-pollination and open-pollination conditions, were not in agreement with GSI. Furthermore, no results were achieved by molecular analyses aimed at cloning genes involved in the GSI system. Vice versa, our cytological observations were in agreement with a sporophytic self-incompatibility (SSI). The molecular attempts to isolate candidates for SSI led us to the cloning of two OeSRK (S-locus Receptor Kinase, the female determinant), two OeSLG (S-locus Glycoprotein, an enhancer of the incompatibility response) and one OeSCR-like (S-locus Cysteine Rich protein, the male determinant) genes. Moreover, quantitative Real-Time PCR assays, replicated using different subdomain-specific primer combinations, revealed an antagonist transcriptional expression pattern in flowers of cultivars Leccino, classified as self-incompatible cultivar, and Frantoio, classified as self-compatible cultivar, for the genes OeSRK and OeSLG. Furthermore, full-length of the OeSRK gene was found specific of pistils, while full-length of SCR-like gene was found specific of anthers. Localization of OeSRK and OeSLG transcripts, were performed by in situ hybridization and it was found localized in the surface of papillar cells. On the whole, a new hypothesis for the genetic system controlling the self-incompatibility reaction can be postulated for olive. Research focused on male-sterility in chicory (Cichorium intybus L.) deals with the discovery and genetic analysis of male sterile mutants of red chicory. Four distinct mutants, which to the best of our knowledge are the first spontaneous male sterile mutants ever discovered and described in the genus Cichorium, were characterized in great details for the developmental pathway of microsporogenesis and gametogenesis, and the inheritance pattern of the gene underlying the male-sterility trait. A quick molecular diagnostic assay was also developed for the early marker-assisted selection of the genotype associated to male sterile plants. Overall data clearly support a nuclear origin and a monogenic control of recessive type for the male-sterility trait in each of the red chicory mutants. Male gametogenesis was documented to arrest at the stage of uninucleate microspores. In particular, cytological observations revealed that microspores degenerate before their release from the tetrads, later showing a collapse of the exine. In the mutants, the totality of microspores proved to be shrunken and much smaller than wild-type ones. Moreover, the fine mapping of the mutant locus was attempted by molecular markers using F2 and BC1 populations segregating for male-sterility. The gene responsible for male-sterility was found tightly linked to a microsatellite of the TC/GA type whose full sequence was recently deposited in the NCBI databases under the accession no. JF748831. A molecular diagnostic assay was then developed to be profitably adopted as a tool of marker-assisted breeding and exploited for an early screening of male-sterile plants within segregating progenies stemmed from back-crosses, with a genotyping error lower than 3%. Four new hybrid varieties of radicchio Rosso di Chioggia with different earliness, spanning from 80 to 110 days, were bred during 2011 by crossing male sterile partially inbred clones, used as seed parents, with wild type highly inbred lines, used as pollen donors. On the whole, the constitution of F1 hybrids seems profitable in a practical breeding scheme and it is also feasible on a large commercial scale by the selection of self-compatible genotypes, for the production of inbred lines, and the identification of male sterile genotypes, to be used as seed parents for the hybridization with unrelated pollen donors. The discovery of non-engineered male-sterility in red chicory will open new frontiers for maximizing crop productivity in this important cultivated vegetable species through the breeding of heterotic F1 hybrid varieties.La presente tesi è mirata allo studio di due importanti barriere riproduttive in piante di interesse agro-alimentare: auto-incompatibilità in olivo e maschio-sterilità in radicchio. L’olivo (Olea europaea L.) è una della più antiche specie coltivate e, nonostante il suo grande impatto economico e culturale, pochi studi sono stati fatti fino ad ora riguardo le barriere riproduttive che incidono sulla produzione finale. Lo scopo della tesi è quello di chiarire il tipo di auto-incompatibilità in olivo fornendo evidenze cito-istologiche e molecolari. L’auto-incompatibilità è il sistema più comune adottato dalle angiosperme per evitare fenomeni di inbreeding, mantenendo in questo modo la diversità all’interno della specie. Attualmente l’olivo è classificato come specie auto-incompatibile di tipo gametofitico (GSI), ma tale classificazione è solo basata su evidenze botaniche come stigma umido e polline bi-nucleato. Approfondite analisi citologiche eseguite su oltre 34.000 granuli pollinici presenti su pistilli di cultivar auto-incompatibili e auto-compatibili non hanno prodotto risultati in accordo con la prevista GSI. Inoltre, il tentativo di isolare geni coinvolti nella GSI non ha prodotto alcun risultato. Le nostre osservazioni citologiche concordano invece con un’incompatibilità di tipo sporofitico (SSI). Esperimenti mirati ad individuare geni coinvolti nella SSI hanno permesso di isolare due geni riconducibili al determinante femminile, OeSRK (S-locus Receptor Kinase), due ad un enhancer della reazione d’incompatibilità, OeSLG (S-locus Glycoprotein) e uno al determinante maschile, OeSCR-like (S-locus Cysteine rich protein). Le analisi di espressione condotte mediante qRT-PCR, usando diverse combinazioni di primer, hanno permesso di evidenziare opposti modelli di espressione per i geni OeSRK e OeSLG fra le cultivar Leccino, classificata come auto-incompatibile, e Frantoio, ritenuta invece auto-compatibile. Inoltre, i full-length di OeSRK hanno mostrato avere una espressione pistillo-specifica, mentre quelli per OeSCR-like una espressione antera-specifica. Ibridazioni in situ hanno permesso di localizzare i trascritti di OeSRK e OeSLG nella superficie delle cellule papillari. Quindi, sulla base delle nostre evidenze, è possibile ipotizzare che l’olivo sia caratterizzato da un nuovo tipo di auto-incompatibilità diverso da quello attualmente riportato in letteratura. Il lavoro svolto sulla maschio-sterilità in radicchio (Cichorium intybus L.) è mirato alla identificazione e alla caratterizzazione di mutanti maschio-sterili. Quattro distinti mutanti, che al meglio delle nostre conoscenze rappresentano i primi mutanti maschio-sterili spontanei scoperti fino ad ora nel genere Cichorium, sono stati dettagliatamente caratterizzati sia per quanto riguarda la microsporogenesi e gametogenesi dal punto di vista citogenetico, sia per quanto riguarda il controllo genetico del carattere. È stato inoltre identificato un marcatore molecolare che può essere impiegato ai fini della selezione assistita dei mutanti maschio-sterili. Nel loro complesso, i dati raccolti in questo lavoro concordano con il controllo della maschio-sterilità da parte di un singolo gene nucleare che agisce in condizioni di omozigosi recessiva. Approfondite analisi citologiche hanno permesso di visualizzare che la gametogenesi maschile è arrestata allo stadio di microspora uni-nucleata. Nel dettaglio, le microspore degenerano prima del rilascio dalle tetradi e, in seguito, mostrano un collasso dell’esina. Nei mutanti è stato dimostrato che la totalità delle microspore sono raggrinzite e molto più piccole se comparate con quelle normali. È stato inoltre isolato un marcatore SSR strettamente associato con il gene responsabile della maschio-sterilità e la sequenza è stata depositata nel database NCBI (accession no. JF748831). Nel corso del 2011 sono state prodotte quattro nuove varietà ibride di radicchio “Rosso di Chioggia” che differiscono per la loro precocità, spaziando dagli 80 ai 110 giorni. Nel loro complesso, i risultati ottenuti dimostrano come mutanti maschio-sterili possano essere impiegati con profitto nella produzione in larga scala di ibridi F1 anche in quelle specie nelle quali, fino ad ora, non era ritenuta possibile la costituzione di varietà ibride. Pertanto, la scoperta di maschio-sterilità genetica spontanea, non transgenica, in radicchio apre nuove frontiere per la produzione di ibridi F1 in questa coltura ed in altre tipologie coltivate della stessa specie