Methods for obtaining interspecific hybrids of Lilium spp. and for identification of their hybrid condition

Dottorato di ricerca in OrtoflorofrutticolturaL’importanza del Lilium per la produzione di fiori recisi è andata enormemente aumentando negli ultimi 30 anni grazie ai progressi del miglioramento genetico, consentendo di immettere sul mercato nuovi ibridi di elevato interesse commerciale. Tra le bulbose il Lilium risulta la specie più importante dal punto di vista economico e, grazie al continuo lavoro di ibridazione, le varietà oggi coltivate sono diventate centinaia, appartenenti generalmente a tre gruppi commerciali di cui il 70% è rappresentato dal gruppo degli ‘ibridi asiatici’, il 20% dal gruppo degli ‘ibridi orientali’ e per il 10% dal gruppo degli ‘ibridi longiflorum’. Recentemente si è andato affermando un quarto gruppo, quello degli ‘LA’, ibridi interspecifici tra ‘L.longiflorum’ e ‘ibridi asiatici’. L’interesse principale dei miglioratori è attualmente rivolto all’ottenimento di nuove ricombinazioni interspecifiche che rappresentano uno strumento necessario al fine di introdurre nuova variabilità genetica all’interno della specie, anche se ciò può essere limitato dal verificarsi di fenomeni di incompatibilità. Le principali difficoltà riscontrate nel raggiungere l’ibridazione interspecifica sono dovute infatti alla comparsa di barriere sessuali, pre- e post-zigotiche, ed è proprio la natura di queste barriere che determina la necessità di individuare il metodo più opportuno da usare per poterle superare. Le barriere di pre-fecondazione sono dovute all’impossibilità del tubetto pollinico di attraversare lo stilo, ad incompatibilità intrinseche nel polline stesso ed ad aborto dell’ovario, quelle post zigotiche sono dovute alla degenerazione dell’endosperma. Presso il CRA-VIV di Pescia, ex ISFlor, è stato avviato un programma di miglioramento genetico, con l’obiettivo di ottenere nuovi ibridi di Lilium di elevato interesse commerciale, per colore, forma e dimensione del fiore. La presente ricerca ha avuto come obiettivo la messa a punto di metodologie per l’ottenimento di nuovi ibridi interspecifici, attraverso il superamento delle barriere sessuali che si verificano tra i parentali. Sono state utilizzate la tecnica del ‘Cut-style’ method, per superare le barriere pre-zigotiche, e la coltura ‘in vitro’ di ovari ed ovuli, per superare le barriere post-zigotiche. È stato predisposto un programma di incroci diallelico completo, utilizzando sei varietà appartenenti ai tre principali gruppi commerciali, oltre ad una serie di incroci che hanno interessato cloni di ibridi asiatici, selezionati precedentemente per il carattere assenza di polline, con alcune specie originarie. Si è proceduto alla realizzazione di incroci manuali, mediante il ‘cut-style method’. Dopo 7, 14 e 21 giorni dal momento dell’impollinazione (DAP), le capsule fecondate sono state prelevate dalla pianta madre e trasferite ‘in vitro’ sui idonei substrati nutritivi. Si è allestita quindi una coltura ‘in vitro’ di sezioni di ovari fecondati, seguita da coltura di ovuli, che dopo circa 180 giorni ha dato luogo, in alcuni casi, a sviluppo dell’embrione. Una parte dei bulbetti ottenuti è stata ambientata in campo per una valutazione fenotipica, mentre la parte restante è stata sottoposta ad analisi del genotipo. Per verificare l’avvenuta fusione dei gameti tra gli individui ottenuti si è proceduto all’esame del loro DNA e dei rispettivi parentali, utilizzando marcatori molecolari (RAPD). L’analisi ha permesso di identificare l’ibrido attraverso la sua ‘caratterizzazione’ con la produzione di un profilo molecolare specifico. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la modalità con cui una cultivar viene utilizzata in un incrocio, cioè come portaseme oppure come impollinatrice, ne influenza la percentuale di riuscita. La cultivar ‘Lombardia’ ad esempio ha dato buoni risultati come portaseme, ma non come impollinatrice. E’ stato osservato che il momento più idoneo per la raccolta degli ovari dalla pianta madre è, per la maggior parte degli incroci, tra il 7° e il 14° giorno dall’impollinazione e che il substrato di coltura ottimale per la coltura degli ovari deve contenere una concentrazione di NAA pari a 1 mg/l. Infine, i profili RAPD, ottenuti impiegando 39 primers sui tre diversi tipi di incrocio testati, uno di tipo LA, uno di tipo AO e uno di tipo LO, hanno evidenziato differenze tra i parentali, molte bande omogenee tra gli ibridi e i parentali femminili ed alcune bande in comune solo tra gli ibridi e i parentali maschili. Queste ultime bande hanno confermato l’avvenuta fecondazione e quindi l’effettivo ottenimento di un ibrido interpsecifico.The importance of Lilium for cut flowers production has been increased over the last 30 years thanks to the progress in genetic improvement, allowing to put on the market new hybrids of high commercial interest. Among the bulbous plants, Lilium is the most important species from an economic point of view and, thanks to the continuous work of hybridisation, several hundreds cultivars are grown today. Generally they belong to three commercial groups: 70% is represented by the “Asiatic hybrids” group; 20% by the “Oriental hybrids” group and 10% by the “Longiflorum hybrids” group. Recently a fourth group has started to be considered, the LA group, interspecific hybrids between ‘Longiflorum’ and ‘Asiatic’. In breeding programmes for ornamental bulbs, interspecific hybridisation is one of the most important ways to introduce new genetic variations, although this may be restricted because of incompatibility. The genus Lilium generally includes allogamous species that because of self incompatibility problems are not able to produce seeds when they are self pollinated. The intraspecific crosses produce a large quantity of seeds, whereas crosses among different species create many problems caused by sexual barriers that hamper interspecific hybridisation, and that can be distinguished between pre-fertilization and post-fertilisation barriers. Pre-fertilisation barriers are due to the impossibility of pollen tube to cross the stylus, to incompatibility between the stylus and the pollen itself, and to ovary abortion. The post-fertilization barriers are due to the degeneration of the endosperm in the developing embryo. A breeding programme on lily was carried out at the CRA-VIV, former ISFlor, with the aim to obtain new Lilium hybrids with high commercial traits, as colour, shape and flowers size. The goal of this research was to develope some methods to obtain new interspecific hybrids of Lilium overcoming the sexual barriers that occur among parental and to verify their hybrid condition. Ovary and ovule culture have been applied to produce interspecific Lilium hybrids. Several crosses among Asiatic hybrids (‘Golf’, ‘Polyanna’ and ‘Gironde’), Oriental hybrids (‘Lombardia’), and Longiflorum hybrids (‘White Haeven’ and ‘White Magic’) were made using just breaking flower buds and cut-style-method. Other crosses were carried out using clones previously selected at the CRA-VIV for several flower traits like colour, shape and pollen absence. Several wild species like L. pumilum, L. regale, L. aurelian, L. leucanthum and L. New Zealand were included. Seven, fourteen and twenty - one DAP (Days After Pollination) ovaries were cut and cultivated ‘in vitro’ using 4 different substrates (MSO, LO1, IAA0.5 and NAA1) for 50 and 60 days. Subsequently the most swollen ovules were taken out from ovary and subcultivated on two substrates, IBA0,5, and NAA0,1. In some cases, after 180 days an embryo developed. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers were used for early identification of interspecific hybrids. RAPD profiles obtained using 39 primers on 3 different types of cross combinations (LA, AO and LO), have highlighted differences between parentals, many homogeneous bands between hybrids and female parents and some bands in common only between hybrids and male parents. These last bands have confirmed an occurred fertilization and the hybrid condition of the progenies