Exploiting genomics and molecular markers for plant genetics and breeding

Co-dominant molecular markers, such as Microsatellites (or Simple Sequence Repeats, SSRs), are powerful tools for basic and applied research programs in crop plant species. Among the possible applications, they are frequently adopted for genetic traceability of food products, for assessing the genetic diversity of local varieties as well as the genetic identity of modern varieties, and also for marker-assisted breeding purposes. In fact, SSR markers are known to be highly polymorphic and discriminant, well distributed throughout the genome, not affected by environmental factors, more efficient and robust than phenotype-based field trials to detect and predict large numbers of distinct differences/traits among genotypes. However, a review of 90 original articles concerning the varietal characterization of some economically relevant crops in Italy, pointed out a lack of wider consensus among the authors regarding the strategy to design and to adopt for genotyping plant varieties with SSR markers. This study emphasized the urgent need to establish a common procedure concerning: i) the criteria adopted for selecting the marker loci and ii) the genetic parameters to be employed for varietal genotyping. In order to demonstrate the potentials of these molecular markers, two case studies are presented. A study performed in Agordino, a very old local Venetian landrace of barley (Hordeum vulgare L.), stressed the concrete possibility to use SSR markers for genetic traceability of local varieties and, in particular, of their food derivatives. The genetic characterization of four main corn (Zea mays L.) landraces grown in Veneto (Italy), namely Sponcio, Marano, Biancoperla and Rosso Piave, by means of SSR markers, has shown great utility for monitoring and preventing further genetic erosion, thus preserving their gene pools, phenotypic identities and qualitative traits. Despite the economic relevance of some crop species, it is common for researchers to deal with the complete lack of SSR data and, more in general, of genomic information. Fennel (Foeniculum vulgare Mill., 2n=2x=22) represents a brilliant example. To overcome this shortage, an Illumina HiSeq 2500 sequencing was carried out in this species, enabling the assembly of the first genome draft in 300,408 scaffolds. The subsequent annotation, permitted to detect and to characterize 103,306 SSR regions. Of these 40 were randomly chosen to design specific primer pairs, preliminary tested and 14 were successfully validated using a core collection of 118 fennel individuals potentially useful for F1 hybrid development. Moreover, the first fennel leaf transcriptome was produced overlapping two transcriptomes, one assembled de novo, the other with an in silico genome-guided approach. A total of 47,775 out of the 79,263 assembled transcripts were annotated and, among them, 11,853 loci contained a putative full-length CDS. Detailed analysis revealed 1,011 transcripts encoding for transcription factors (TFs), 6,411 EST-SSRs, 43,237 SNPs and 3,955 In/Dels. Assembled transcripts were also used to conduct the identification of loci related to the t-anethole biosynthesis, the major component of the fennel essential oils, well-known for its capability in reducing mild spasmodic gastro-intestinal pains as well as for its antithrombotic and hypotensive activity. Finally, detailed analysis revealed 1,011 transcripts encoding for transcription factors (TFs), 6,411 EST-SSRs, 3,955 In/Dels and 43,237 SNPs. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) represent another class of co-dominant markers heavily exploited for the discovery of Mendelian inheritance genes and for the analysis of polygenes or QTLs (quantitative trait loci). Adopting a Genotyping By Sequencing (GBS) approach, the first SNP-based genetic linkage map of leaf chicory (Cichorium intybus L. subsp. intybus var. foliosum, 2n=2x=18) was built using a BC1 population segregating 1:1 for the male sterility (ms) trait. This study enabled the genetic localization of the nuclear ms gene, termed Cims1, within linkage group 9 and the identification of four SNPs that proved to fully co-segregate with the target gene. Considering that this form of male-sterility, controlled by a single recessive nuclear gene, is one of the most effective methods to develop F1 hybrids, our data will be exploitable for marker-assisted selection purposes.I marcatori co-dominanti, tra cui i Microsatelliti (o SSR), sono strumenti molecolari ampiamente utilizzati nell’ambito della ricerca di base e applicata in specie di interesse alimentare. Tra le possibili applicazioni ricordiamo il loro impiego per studi di tracciabilità genetica di prodotti alimentari, per analisi di diversità genetica di varietà locali e identità genetica di varietà moderne e per il miglioramento genetico. Infatti gli SSR sono noti per essere altamente polimorfici e discriminanti, ben distribuiti all’interno del genoma, non influenzati da fattori ambientali, più efficienti e robusti dei marcatori fenotipici nelle analisi di diversità tra genotipi. Tuttavia, un’indagine condotta su 90 articoli scientifici basati sull’identificazione varietale delle specie economicamente più rilevanti in Italia, ha messo in luce la mancanza di un approccio comune tra gli autori in relazione alle strategie da utilizzare per questo tipo di studi. Inoltre lo studio ha evidenziato il bisogno improrogabile di stabilire procedure comuni riguardanti: i) i criteri da adottare per la scelta dei marcatori SSR ii) i parametri genetici più utili a questo scopo. Per dimostrare il potenziale di questa classe di marcatori, vengono presentati due casi studio. Il primo, che ha come oggetto Agordino, un’antica varietà locale veneta di orzo (Hordeum vulgare L.), ha permesso di enfatizzare la possibilità concreta di utilizzare i microsatelliti per la tracciabilità genetica di varietà locali ed, in particolare, di prodotti alimentari derivati. La caratterizzazione delle quattro principali varietà di mais (Zea mays L.) in Veneto -Sponcio, Marano, Biancoperla e Rosso Piave- attraverso marcatori SSR si è dimostrata invece estremamente utile per monitorare e prevenire fenomeni di erosione genetica, consentendo così di preservare la ricchezza genetica che le caratterizza, la loro identità fenotipica e i tratti qualitativi. Nonostante l’interesse economico di alcune specie, non è così raro per i ricercatori doversi interfacciare con la totale mancanza di dati SSR e, più in generale, di informazioni genomiche. Finocchio (Foeniculum vulgare Mill., 2n=2x=22), a tal proposito, rappresenta un esempio calzante. Per sopperire a questa carenza di dati, è stato condotto un sequenziamento su piattaforma Illumina Hiseq 2500, permettendo così l’assemblaggio del prima bozza del genoma di finocchio in 300408 sequenze. La successiva annotazione ha consentito quindi di individuare e caratterizzare 103306 regioni altamente ripetute. Di queste, 40 scelte in modo casuale per il disegno di primer specifici, sono state testate e 14 sono state validate su una popolazione commerciale di 118 individui potenzialmente fruibili per lo sviluppo di ibridi F1. Inoltre, il primo trascrittoma di foglia di finocchio è stato prodotto sovrapponendo due trascrittomi uno assemblato de novo e l’altro in silico, tramite allineamento sul genoma. 47775 dei 79263 trascritti totali sono stati annotati e 11853 risultano contenere una sequenza codificante completa. L’assemblaggio ha quindi consentito l’identificazione di loci coinvolti nella via biosintetica dei trans-anetolo, componente preponderante degli oli essenziali di finocchio e noto per le sue abilità nel ridurre dolori gastro-intestinali nonché per la sua attività antitrombotica e ipotensiva. Analisi dettagliate hanno infine messo in luce 1011 trascritti codificanti per fattori di trascrizione (FT), 6411 microsatelliti (EST-SSR), 3955 inserzioni/delezioni e 43237 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). I marcatori di tipo SNP costituiscono un’altra classe di marcatori codominanti largamente sfruttati per la caratterizzazione di geni ad eredità Mendeliana e per l’analisi di poligeni o loci codificanti tratti quantitativi (QTL). Attraverso un approccio di genotipizzazione tramite sequenziamento (GBS) è stata costruita la prima mappa genetica in radicchio (Cichorium intybus L. subsp. intybus var. foliosum, 2n=2x=18) utilizzando una popolazione BC1 (ottenuta tramite tecniche di reincrocio) segregante 1:1 per il tratto “maschio sterilità”. Questo studio ha permesso di localizzare finemente il gene nucleare della maschio sterilità Cims1 all’interno del gruppo di associazione 9 e ha consentito l’identificazione di 4 SNP co-segreganti a 0 cM con il suddetto gene. Considerato che questa forma di maschio-sterilità, controllata da un singolo allele recessivo nucleare, è uno dei metodi più efficaci per produrre ibridi F1, questi risultati saranno di estrema utilità per studi di miglioramento genetico