TpF1 from Treponema pallidum activates inflammasome and promotes the development of Regulatory T cells

Syphilis is a chronic disease caused by the spirochaete Treponema pallidum. Syphilis is acquired by direct contact, usually sexual, with active primary or secondary lesion. The infection also occurs when Treponema crosses the placenta to infect fetus in a pregnant woman. Of particular importance is the recognition that syphilis infection greatly increases the transmission and acquisition of HIV (Ficarra & Carlos, 2009). After the Second World War, the introduction of penicillin, serological controls of pregnant women and treatment of infected partners resulted in a decrease of the disease incidence. Subsequently, periods of increased incidence alternated with decreased ones occurred, in relation to funds committed to programs to control public health, socioeconomic level of population and behaviours of infected people. Nowadays, the syphilis still constitutes an important global health problem and it remains a major sexually transmitted disease, particularly in developing countries, although an increase in new cases has also been recently noted in USA as well as in Europe (Golden et al., 2003; Fenton et al., 2008). Syphilis is an evolving disease and can be divided in three main stages. In the first stage, a red papule appears at the site of inoculation, usually genitals. Within the first few days, the papule ulcerates, producing the typical chancre of primary syphilis, which is painless and filled with treponemes. The chancre is accompanied by regional lymphadenopathy. If untreated, the treponemes can also proliferate in the chancre and can be transported via lymphatics to the bloodstream, from which they disseminate throughout the body. Secondary syphilis is a systemic disease. The most common manifestation of this stage is a disseminated muco-cutaneous rash, which usually resolves spontaneously. In untreated patients, the symptoms are absent for a variable period of time, which is called latent stage. Afterwards, one-third of untreated patients can develop symptomatic late syphilis; this is subdivided into gummatous syphilis, neurosyphilis and cardiovascular syphilis. The third stage can be extremely disfiguring and can lead to patient death (Lafond & Lukehart, 2006). During early infection T. pallidum is able to elicit a vigorous inflammation and the ensuing adaptive immune response. The latter is a typical cell-mediated immune response, characterized by Th1 predominance. T helper cells are believed to mediate bacterial clearance primarily through the production of cytokines (such as IFN-γ), which then activate macrophages. The latter then engulf and kill opsonised bacteria (Leader et al., 2007). Nevertheless, although cell-mediated immune response take part in the course of syphilis, T. pallidum often manages to evade eradication and, in untreated individuals, may trigger chronic infection. Efforts to elucidate the molecular mechanisms of T. pallidum virulence have been hampered by some of its characteristics, which make it difficult to be cultured in vitro. Little is know about how T. pallidum causes the syphilis, and in particular how T. pallidum survives within the host despite the immune response, thus giving a chronic disease, remains an unexplored issue. In the present study, we investigated the role of a T. pallidum protein, called antigen 4D or TpF1 in the pathogenesis of syphilis. TpF1 is an oligomeric protein of 190 kDa localised in the periplasm of T. pallidum (Cunningham et al., 1988) . TpF1 has been identified and purified in 1984 (Fehniger et al., 1984), but its function is still unknown. We have selected TpF1 as a potential candidate to have a role in syphilis for different reasons. In 1986, Coates and colleagues reported that TpF1 induces an important seroconversion particularly in primary syphilis patients (Coates et al., 1986). Borestein et al. demonstrated that the intra vena administration of TpF1 in subsequently treponema-challenged rabbits reduced the mean incubation periods for lesion development, suggesting a role for this protein in inducing an inflammatory and immune response (Borenstein et al., 1988). Moreover, TpF1 belongs to the Dps-like protein family and it is homolog to two proteins of this family, HP-NAP from Helicobacter pylori and NAPA from Borrelia Burgdorferi. These proteins have been studied in our lab and their pro-inflammatory and immune-modulatory properties have been demonstrated to be crucial in sustaining chronic diseases (Amedei et al., 2006; Codolo et al., 2008). Therefore, the aim of our study was to verify whether TpF1 might have a role in triggering inflammation and, eventually, in down-modulating the adaptive immune response, thus permitting the survival of the bacterium in the host. Accordingly, several years ago it has been proposed the involvement of T lymhocytes endowed with immune suppressive activity to explain the inability of the host to clear the bacterium (Tabor et al., 1984; Tabor et al., 1987) . Firstly, we examined the pro-inflammatory potential of TpF1 and we demonstrated that the antigen activates monocytes to express and release the pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TNF-α, suggesting that TpF1 may contribute to inflammation. Considering that TpF1 induces the production of IL-1β, a cytokine that follows a peculiar way of secretion which involves the activation of the so-called “inflammasome” complex (Martinon et al., 2002), we investigated the mechanism by which TpF1 activates inflammasome. We demonstrated that TpF1 induces endogenous ATP release by monocytes. The engagement of P2X7 receptor by ATP results in the activation of inflammasome, leading, as a final effect, to the release of IL-1β. In addition, we observed that TpF1 contributes to maintenance of inflammation by preventing the natural occurring apoptosis in monocytes, via the induction of the expression of the anti-apoptotic proteins Mcl-1 and Bcl-XL. Despite the fact that a strong specific immune response is evoked after establishment of bacterial infection, in absence of antibiotic treatment T. pallidum survives in the host and then syphilis evolves as chronic disease. Several mechanisms have been suggested to ensure the persistence of the microorganism in the host. As reported above, several years ago, Tabor and colleagues suggested that T. Pallidum infection induces the production of “suppressor T cells”, which, they showed, suppress the activity of macrophages (Tabor et al., 1984; Tabor et al., 1987). We demonstrated that, upon TpF1 stimulation, peripheral blood monocytes produce also IL-10 and TGF-β, key cytokines in the differentiation of T cells towards the T reg phenotype. In our work, we reported for the first time that CD4+CD25+high T reg cells are increased in the peripheral blood of patients with secondary syphilis. Furthermore, we found that these cells are Foxp3 positive and are able to produce TGF-β. Finally, we demonstrated that TpF1 is able to promote the expansion of T reg cells isolated from secondary syphilis patients, as well as the release by these cells of TGF-β. In conclusion, TpF1 of T. pallidum displays peculiar activities on inflammatory and immune responses, which are relevant for the pathogenesis of secondary syphilis. On one hand, TpF1 stimulates inflammation and tissue destruction by triggering both the production and release of several pro-inflammatory cytokines, such as TNF-a, IL-6 and IL-1β; on the other hand, however, TpF1 inhibits the immune response, i.e. the clearance of the pathogens, via the induction of the a T reg response.La sifilide è una malattia cronica causata dalla spirocheta Treponema pallidum. Essa è acquisita per contatto diretto, usualmente sessuale, attraverso una lesione primaria o secondaria attiva. L’infezione può trasmettersi anche per via verticale, nel caso in cui Treponema attraversi la placenta in una donna gravida recante l’infezione. Di particolare importanza è la scoperta che la sifilide aumenta il rischio di trasmettere e di acquisire il virus dell’HIV (Ficarra & Carlos, 2009). Dopo la seconda Guerra mondiale, l’introduzione dell’uso della penicillina, i test sierologici alle donne incinta ed il trattamento dei partner infetti hanno diminuito di molto l’incidenza della patologia. Successivamente, si è assistito ad un alternarsi di aumento e diminuzione dei casi, in rapporto alle risorse destinate ai programmi di sorveglianza della malattia, al livello socioeconomico del paese e a variazioni nei comportamenti delle persone infette. Oggi, la sifilide costituisce ancora un importante problema di salute pubblica e rimane una delle maggiori malattie trasmissibili sessualmente, in particolar modo nei paesi in via di sviluppo, anche se un aumento dei casi è stato registrato negli ultimi anni anche negli Stati Uniti e in Europa (Golden et al., 2003; Fenton et al., 2008). La sifilide è caratterizzata da tre stadi evolutivi. Inizialmente appare una papula rossa nel sito d’infezione, in genere rappresentato dai genitali. Entro pochi giorni la papula si ulcera, producendo la tipica cancrena della sifilide primaria, che è indolore e ricca di batteri. La cancrena è accompagnata da una linfoadenopatia regionale. In assenza di trattamento antibiotico, i batteri possono proliferare a livello della cancrena e possono raggiungere con il sistema linfatico il circolo sanguigno, attraverso il quale disseminano per tutto il corpo. Questo stadio, che definisce la sifilide secondaria è dunque una tipica malattia sistemica. La manifestazione più ricorrente di questo stadio è un eritema disseminato, che in genere si risolve spontaneamente. Nei pazienti non trattati i sintomi sono assenti per un periodo di tempo variabile, che viene chiamato fase latente. In circa un terzo dei pazienti non trattati si può sviluppare la sifilide tardiva sintomatica. Questa include la gomma sifilitica, la neurosifilide e la sifilide cardiovascolare. Il terzo stadio può portare a lesioni molto deturpanti ed anche alla morte del paziente (Lafond & Lukehart, 2006). Nelle prime fasi dell’infezione T. pallidum è in grado di attivare una potente risposta infiammatoria ed immunitaria adattativa. Quest’ultima è tipicamente una risposta di tipo cellulo-mediata, caratterizzata da una predominanza di cellule T helper 1 (Th1). Si ritiene che i linfociti Th medino l’eliminazione del batterio attraverso la produzione di citochine come l’INF-γ, che potenzia il potere microbicida dei macrofagi (Leader et al., 2007). I macrofagi poi fagocitano e uccidono i batteri opsonizzati. Nonostante ciò, sebbene nel corso della sifilide intervenga risposta immunitaria di tipo cellulo-mediata, T. pallidum spesso riesce ad evitare di essere eliminato e, in pazienti non trattati, può portare ad un’infezione cronica. Gli sforzi fatti per chiarire i meccanismi molecolari di virulenza di T. pallidum sono stati ostacolati da alcune sue caratteristiche, che lo rendono difficile da coltivare in vitro. Dato che poco si conosce riguardo ai meccanismi attraverso cui T. pallidum causa la sifilide, abbiamo deciso di indagare il ruolo di una proteina, prodotta dal batterio, chiamata antigene 4D o TpF1, nell’insorgenza della patologia. TpF1 è una proteina oligomerica di 190 kDa, localizzata nel periplasma (Cunningham et al., 1988). Nonostante TpF1 sia stata identificata e purificata nel 1984, la funzione non è ancora nota (Fehniger et al., 1984). Abbiamo deciso di studiare TpF1 per diverse ragioni, qui di seguito brevemente riassunte. Nel 1986, Coates e colleghi hanno riportato che TpF1 induce una notevole seroconversione, in particolare nei pazienti con sifilide primaria (Coates et al., 1986). Borenstein et al, hanno dimostrato che la somministrazione intra vena di TpF1 in conigli, che venivano successivamente esposti a Treponema, riduceva il tempo dello sviluppo delle lesioni, suggerendo un ruolo per questa proteina nell’induzione di una risposta infiammatoria e/o immunitaria (Borenstein et al., 1988). Inoltre, TpF1 appartiene alla famiglia delle Dps-like (DNA-binding proteins from starved cells) ed è omologa a due proteine di questa famiglia, HP-NAP di Helicobacter pylori e NAPA di Borrelia Borgdoferi (Amedei et al., 2006; Codolo et al., 2008). Queste due proteine sono state studiate nel nostro laboratorio e le loro proprietà immunomodulanti sono state dimostrate essere cruciali nel sostenere patologie croniche. Alla luce di queste considerazioni abbiamo dunque voluto verificare se TpF1 potesse avere un ruolo nello scatenare l’infiammazione ed, eventualmente, nel reprimere la risposta immunitaria adattativa, permettendo così al batterio di sopravvivere nell’ospite. In accordo, alcuni anni fa è stato proposto il coinvolgimento dei linfociti T dotati di attività immunosoppressiva per spiegare l’incapacità dell’ospite di eliminare il batterio (Tabor et al., 1984; Tabor et al., 1987) . Inizialmente, abbiamo indagato il potenziale pro-infiammatorio di TpF1 ed abbiamo dimostrato che l’antigene attiva i monociti ad esprimere e rilasciare le citochine pro-infiammatorie quali IL-1β, IL-6 e TNF-α, suggerendo che TpF1 contribuisca all’infiammazione. Considerando la capacità di TpF1 di indurre la produzione di IL-1β, abbiamo indagato il meccanismo molecolare attraverso cui TpF1 promuove questo effetto. Abbiamo dimostrato che TpF1 induce il rilascio di ATP endogeno dai monociti. Il legame dell’ATP al recettore P2X7 determina l’attivazione dell’inflammasoma, portando, come effetto finale, al rilascio di IL-1β. Inoltre, abbiamo osservato che TpF1 contribuisce al mantenimento dell’infiammazione prevenendo il naturale decorso apoptotico dei monociti, attraverso l’induzione dell’espressione di proteine anti-apoptotiche, quali Mcl-1 e Bcl-XL. Nonostante la specifica e potente risposta immunitaria che si instaura in seguito all’infezione batterica, in assenza di un trattamento antibiotico, T. pallidum può sopravvivere nell’ospite e la sifilide può evolvere in una malattia cronica. Sono stati suggeriti diversi meccanismi che potrebbero garantire la persistenza del microrganismo nell’ospite. Come riportato sopra, diversi anni fa Tabor e colleghi suggerirono che l’infezione con T. pallidum inducesse la produzione di cellule T soppressorie, inibenti l’attività dei macrofagi (Tabor et al., 1984; Tabor et al., 1987). Abbiamo dimostrato che monociti, isolati da sangue periferico e stimolati con TpF1, producono IL-10 e TGF-β, citochine cruciali nel differenziamento dei linfociti T verso il fenotipo T regolatorio. Nel nostro lavoro, abbiamo riportato, per la prima volta, che nel sangue periferico di pazienti con sifilide secondaria c’è un aumento dei linfociti T regolatori CD4+CD25+high. Queste cellule sono positive per il fattore di trascrizione Foxp3 e sono in grado di produrre TGF-β. Inoltre, abbiamo dimostrato che TpF1 promuove l’espansione dei linfociti T regolatori isolati da pazienti con sifilide secondaria ed induce la produzione da parte degli stessi di TGF-β. In conclusione, la proteina TpF1 di T. pallidum possiede una peculiare attività immunomodulante che è attesa ripercuotersi in vivo sia sulla risposta infiammatoria che immunitaria adattativa. Da un lato, TpF1 stimola l’infiammazione e potrebbe contribuire alla distribuzione del tessuto inducendo la produzione e il rilascio di citochine pro-infiammatorie, come TNF-α, IL-6 e IL-1β; d’altra parte, TpF1 inibisce la risposta immunitaria, ovvero l’eliminazione del batterio, attraverso l’induzione di una risposta T regolatoria