Functional and molecular alterations of the enteric nervous system in murine models of gut neuropathy

The interaction between cellular constituents of gastrointestinal (GI) tract and commensal microflora is essential for the maintenance of mucosal barrier, promotion of the development of the GI system and modulation of enteric functions such as motility, secretion, mucosal immunity and visceral sensitivity. Alterations in the composition of the gut microflora have been associated to several GI disorders (e.g. inflammatory bowel disease, IBD, and irritable bowel syndrome, IBS) while changes in intestinal microbiota during infancy and adolescence, caused by infection or antibiotic therapy, appear to predispose to the onset of these diseases. Furthermore, dysfunctions of the enteric nervous system (ENS) such structural abnormalities and/or changes in the content of neurotransmitters, have been associated with the onset of IBD and IBS. In this context, a sophisticated system of proteins, so-called Toll-like receptors (TLRs), plays a key role in mediating the inflammatory response against pathogens and triggers beneficial signals to ensure tissue integrity under physiological and pathological conditions. Polymorphisms in genes encoding TLRs, including TLR2 or TLR4, have been associated with different phenotypes of disease extent and severity in patients with GI disorders. In this study we characterized structural and functional alterations of murine ENS induced by: i) anomalies in the composition of the microbiota, ii) changes in innate immunity response, mediated by TLR2 and/or TLR4 following recognition of gut commensal microflora, iii) alterations in the expression of the protein catechol-O-methyltransferase (COMT), involved in the turnover of several neurotransmitters present in both the ENS and the central nervous system, such as dopamine and other catecholamines. Functional and structural studies in male mice C57BL/6J WT and TLR2-/- (21 ± 5 days old) highlighted the presence of significant alterations of intestinal contractility and ENS architecture in ileal preparations of genetically modified mice. Once demonstrated that the deletion of the gene encoding for TLR2 determines ENS structural and functional abnormalities, it was examined whether TLR2-mediated functional anomalies were hematopoietic cell-independent. Therefore, bone marrow chimeric mice were generated and experimental transfers were as follows: WT donors into WT recipients (WT?WT), WT donors into TLR2-/- recipients (WT? TLR2-/-), TLR2-/- donors into TLR2-/- recipients (TLR2-/-? TLR2-/-), and TLR2-/- donors into WT recipients (TLR2-/-? WT). Contractility experiments conducted in bone marrow chimeric mice evidenced that the structure and function of ENS were similar in WT mice given either WT or TLR2?/? bone marrow, indicating that TLR2 signaling in nonhematopoietic cells is a main contributor to ENS health. To investigate the role of the TLR2-microbiota axis in the homeostasis of ENS and enteric smooth muscle we depleted gut microbiota by intragastric administration of a cocktail of broad spectrum antibiotics (50 mg/kg vancomycin, 100 mg/kg neomycin, 100 mg/kg metronidazol and 100 mg/kg ampicillin) twice a day for 14 days in adolescent mice (aged 21 ± 5, ABX). Mice resulted to be successfully depleted after antibiotic treatment and displayed significantly smaller spleens and enlarged ceca, macroscopically phenocopying germ-free mice. This condition, already highlighted in IBS subjects, appears to be due to a delayed emptying of feces from enlarged cecum, due to impaired motility. Functional studies in ABX mice revealed a significant decrease in gastrointestinal transit, accompanied by alterations in the rate of fecal pellet expulsion and stool water content, to suggest that continuous presence of microbial stimuli is required to control intestinal motility and potentially mucosal barrier permeability. Immunohistochemical analysis of ileal preparations from ABX mice showed abnormalities in the distribution and expression of the the pan-neuronal marker HuC/D, the glial structural protein GFAP (glial fibrillary acidic protein) and the cytoplasmatic and nuclear glial calcium-binding protein S100?. Overall these observations highlight the primary role of commensal microbiota in the preservation of the structural integrity of the enteric neuronal and glial network. Given the importance of proper composition of commensal microbiota in the maintenance of neuronal network and neurochemical coding of the ENS intestinal contractility was evaluated in isolated ileal segments from control and ABX mice. These analyses evidenced impaired neuromuscular function associated to antibiotic treatment to further underline that proper neuromuscular function relies on a correct composition of gut microbiota. The primary role of TLR2 signaling in controlling gut motor function was further confirmed by testing the effect of TLR2 engagement by Pam3-CSK4 (a TLR2/TLR1 agonist) in ABX mice. Intraperitoneal supplementation with Pam3CSK4, during the second week of antibiotic treatment, partially corrected these anomalies in ENS structure and intestinal contraction, supporting the presence of a dialogue between commensal microbiota and TLR2, essential for the modulation of neuromuscular function. To highlight the key role of gut microbiota?TLR2-ENS axis in maintaining intestinal function and development of the ENS, male C57Bl/6 mice (2 weeks old) were daily treated subcutaneously with OxPAPC (a TLR2 and TLR4 inhibitor) for 7 days. In vivo inhibition of both TLR2 and TLR4 determined a significant alteration of receptor and non-receptor-mediated neuromuscular responses, in a manner similar to that found in TLR2-deficient mice, providing evidence that TLR2 and TLR4 signaling is essential in ensuring the structural and functional integrity of the SNE during adolescence. Then, we investigate changes in gene expression of GluN1 subunit of N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) receptor of the neurotransmitter glutamate in the myenteric plexus of ileal preparations from control and ABX mice. Antibiotic-mediated depletion of commensal microflora determined increased mRNA levels of GluN1, suggesting that commensal microbiota is involved in modulating visceral sensitivity. Finally, the role of brain-gut axis in ENS homeostasis was assessed in an animal model of psychiatric disease, characterized by the genetic reduction of catechol-o-methyltransferase (COMT), an enzyme responsible for the degradation of catecholamines. In female animals genetic-driven COMT defective activity determined increased levels of NO associated to altered ENS architecture, neurochemical coding and visceral sensitivity. We cannot exclude that such changes may be involved in the pathogenesis of IBS in female patients, underlining a potential link with psychiatric disorders.L'interazione fra costituenti della parete intestinale e microflora commensale costituisce il principale artefice del mantenimento della barriera mucosale, della promozione dello sviluppo del tratto gastrointestinale (GI) e della modulazione di funzioni GI, quali motilità, secrezione, immunità mucosale e sensibilità viscerale. Un'alterata microflora è stata associata a disordini GI (malattie infiammatorie croniche intestinali, MICI o sindrome dell'intestino irritabile, IBS) mentre cambiamenti del microbiota intestinale durante le fasi dell’infanzia e dell’adolescenza, causati da infezioni o antibiotici, predispongono all'insorgenza di queste malattie. Inoltre, disfunzioni del SNE quali anomalie strutturali e/o variazioni nel contenuto di neurotrasmettitori, sono state associate all'insorgenza sia di MICI che di IBS. In questo contesto, giocano un ruolo chiave i recettori Toll-like (Toll-like receptors, TLRs), un sofisticato sistema di proteine che mediano la risposta infiammatoria contro agenti patogeni e attivano segnali benefici assicurando l'integrità tissutale in condizioni fisiologiche e patologiche. Polimorfismi nei geni che codificano i TLRs, inclusi il TLR2 ed il TLR4, sono stati associati a fenotipi diversi di malattia nei pazienti affetti da disordini GI. In questo studio sono state caratterizzate le alterazioni strutturali e funzionali del SNE murino indotte da i) anomalie nella composizione del microbiota, ii) cambiamenti nel segnale dell’immunità innata, mediato dai recettori TLR2 e 4 ed implicato nel riconoscimento di profili molecolari derivanti dalla microflora intestinale e iii) variazioni di espressione della proteina catecol-O-metiltransferasi (COMT), implicata nel turnover di neurotrasmettitori del SNE e del sistema nervoso centrale, come la dopamina e altre catecolamine. Tramite studi funzionali e strutturali in vitro utilizzando topi maschi C57BL/6J WT e TLR2-/- di pari età (21±5 giorni di età) è stata evidenziata la presenza di alterazioni significative della contrattilità intestinale e dell'architettura dell'ENS nei preparati di ileo provenienti dai topi geneticamente modificati. Una volta dimostrato che la delezione del gene codificante per il recettore TLR2 determinava anomalie strutturali e funzionali nel SNE, è stato valutato se il segnale mediato dal TLR2 derivasse da cellule immunocompetenti ematopoietiche oppure dalle diverse popolazioni cellulari esprimenti questo recettore e residenti nell’intestino, come i neuroni, la glia, le cellule muscolari lisce e le cellule endoteliali. Sono stati così generati topi chimera cioè portatori di cellule geneticamente distinte originate da topi 'donatori' WT e TLR2-/- di pari sesso ed età, quali: i) topi WT che hanno ricevuto il midollo osseo da topi WT donatori (WT?WT), ii) topi WT che hanno ricevuto il midollo osseo da topi TLR2-/- donatori (TLR2-/-?WT), iii) topi TLR2-/- che hanno ricevuto il midollo osseo da topi TLR2-/- donatori (TLR2-/-?TLR2-/-), iv) topi TLR2-/- che hanno ricevuto il midollo osseo da topi WT donatori (WT?TLR2-/-). Esperimenti di contrattilità condotti nei topi chimera hanno dimostrato che le alterazioni della funzione neuromuscolare non sono dipendenti dal segnale TLR2 mediato dalle cellule ematopoietiche. Pertanto la valutazione dei topi deficienti per il TLR2 ha evidenziato il ruolo primario di questo recettore nel conservazione dell'integrità strutturale e funzionale del SNE. Al fine di approfondire il ruolo dell'asse TLR2-microbiota nell’omeostasi del SNE e della muscolatura liscia enterica è stato messo a punto un modello animale di deplezione di microbiota intestinale attraverso la somministrazione intragastrica di 4 antibiotici, ampicillina (100 mg/kg), metronidazolo (100 mg/kg), neomicina (100 mg/kg) e vancomicina (50 mg/kg) due volte al giorno per 14 giorni a topi WT adolescenti (21±5 giorni di età; topi ABX). Da una prima valutazione il trattamento antibiotico ha determinato l’aumento delle dimensioni e del peso del cieco, caratteristica già osservata in topi adulti germ-free, ossia privi di microrganismi dalla nascita. Questa condizione, già evidenziata in soggetti affetti da IBS, sembra dovuta ad un ritardato svuotamento delle feci dal cieco ingrossato, ad indicare una compromissione della motilità dimostrata da un ritardato transito a livello del colon. Successivamente gli studi funzionali in vivo hanno rivelato una diminuzione significativa del transito gastrointestinale, accompagnata da alterazioni nella frequenza del pellet fecale e nel contenuto di acqua nelle feci. Tali risultati hanno evidenziato che il trattamento antibiotico determina una riduzione della motilità intestinale con possibili effetti a livello della barriera mucosale. In seguito, analisi immunoistochimiche su preparati di ileo provenienti da topi ABX hanno evidenziato anomalie nella distribuzione ed espressione della proteina marcatore pan-neuronale HuC/D, della proteina gliale strutturale GFAP (glial fibrillary acidic protein) e della subunità ? della proteina S-100, marcatore gliale nucleare e citoplasmatico in grado di legare il calcio. Tali osservazioni sembrano confermare come la deplezione del microbiota intestinale possa influenzare l'integrità della rete neuronale e gliale enterica. Data l’importanza di una corretta composizione del microbiota commensale nel mantenimento della rete nervosa e del codice neurochimico del SNE è stata valutata la funzione intestinale in vitro mediante esperimenti di contrattilità utilizzando la tecnica dell'organo isolato su segmenti di ileo provenienti da topi CNTR e ABX. Queste analisi hanno evidenziato anomalie nell’attività contrattile neuromuscolare associate dopo trattamento antibiotico sottolineando l’importanza di una corretta composizione del microbiota nel mantenimento dell’attività motoria enterica. In parallelo, è stato ulteriormente dimostrato il ruolo primario del segnale mediato dal TLR2 nel controllo dell’attività neuromuscolare, saggiando l’effetto del Pam3CSK4, ligando del TLR2, sulla disfunzione contrattile indotta dalla terapia antibiotica. La somministrazione di Pam3CSK4 per via intraperitoneale, durante la seconda settimana di trattamento antibatterico ha prevenuto l’entità del danno motorio intestinale, a sostegno della presenza di un dialogo tra il microbiota ed TLR2, fondamentale per la modulazione della funzione neuromuscolare. Per evidenziare l'importanza dell'asse microbiota-TLR2-SNE nel mantenimento della funzione intestinale e nello sviluppo del SNE è stato somministrato l'OxPAPC, inibitore dei segnali mediati sia da TLR2 che da TLR4, a topi WT adolescenti per via sottocutanea per 7 giorni consecutivi. Il trattamento con OXPAPC ha causato un’alterazione significativa della risposta neuromuscolare sia recettore-mediata che non nei topi trattati rispetto al controllo, già evidenziata in topi deficienti per il recettore TLR2, confermando l’importanza del segnale mediato da tali recettori nell'assicurare l’integrità funzionale e strutturale del SNE durante l'adolescenza. In parallelo sono state studiate le vie di neurotrasmissione, coinvolte nella sensibilità viscerale, nel modello animale di deplezione della microflora, analizzando l’espressione genica di GluN1, subunità funzionale del recettore NMDA del glutammato. E’ stato osservato un incremento dei livelli di mRNA di GluN1 nel plesso mienterico dei preparati di ileo provenienti dai topi ABX, evidenziando gli effetti di alterazioni della composizione del microbiota intestinale sulla sensibilità viscerale. Infine è stato approfondito il ruolo dell’asse ‘cervello-intestino’ attraverso la valutazione strutturale e funzionale del SNE in un modello animale di malattie psichiatriche, caratterizzato dalla riduzione genica di COMT, enzima responsabile della degradazione delle catecolamine. In animali di sesso femminile è stato dimostrato che gli aumentati livelli di catecolamine, dovuti alla riduzione genica di COMT, determinano alti livelli di NO e sofferenza neuronale con conseguente accelerato transito GI e sensibilità viscerale, a confermare il ruolo primario di polimorfismi funzionali di COMT in donne affette da IBS