A natural polymer (NPX) as a new adjuvant for breast cancer vaccination strategies

The use of proteins or peptides as immunogens is attractive for the development of vaccines, especially cancer vaccines, but requires efficient and safe adjuvant formulations to overcome their intrinsic weak immunogenicity. Although dozens of different adjuvants have been shown to be effective in preclinical and clinical studies, alum remains the only one approved for human use in the USA and the most employed worldwide, but it turned out to be inefficient in cancer vaccine formulations. Indeed, the prerequisites for an ideal cancer adjuvant differ from conventional adjuvants. Since cancer vaccines target self-antigens, the ideal cancer adjuvant must be extremely potent to circumvent immune tolerance, but it must also be safe to avoid autoimmune reactions. Of note, recent studies indicate that effective therapeutic and preventive cancer vaccines require the induction of a more balanced T helper 1 (Th1)/Th2 immune response, characterized by the presence of a strong cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) activity, and the production of IgG subclasses with specific effector functions. For example, efficient tumor prevention in mice is associated with high levels of IgG2a and IgG2b subclasses, which are considered the most potent inducers of complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) in rodents. To solve all these problems, new generation vaccines often incorporate toll-like receptors (TLRs) agonists. Among them, natural polymers (NPs) that can act as damage-associated molecular patterns (DAMPs) or pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), are emerging as a new efficient class of vaccine adjuvants due to their ability to orchestrate the cross-talk between innate and adaptive immunity. In particular, NPs induce the maturation of dendritic cells (DCs) and finely regulate the balance between Th1 and Th2 responses, thus inducing potent and long-lasting humoral and cellular responses. Moreover, they are biocompatible, biodegradable, non-toxic, non-immunogenic, and non-inflammatory. This project aimed at validating our NP, called NPX for patent constraints, as a new TLR agonist and carrier of immunogens for the design of more efficient and safer cancer vaccines, and comparing its adjuvanticity with alum. To this aim, NPX was chemically linked to the extracellular domain (ECD) of the rat form of the epidermal growth factor receptor (rHER2/neu), or to short peptide sequences derived from the ECD of rHER2/neu, and the resulting bioconjugates were used for immunization of both BALB/c and BALB-neuT transgenic mice. In this work, we demonstrated that NPX has an extremely satisfactory safety profile, as no local side effects were observed in vaccinated mice. Moreover, NPX induced strong antigen-specific immune reactions very efficiently. In fact, even though both alum- and NPX-adjuvanted formulations induced high humoral immune responses against rHER2/neu, NPX-vaccinated BALB/c mice disclosed IgG titers that were about two-fold higher than those calculated for alum. Of note, only conjugation with NPX induced a detectable humoral response against rHER2/neu-derived peptides. Both adjuvants induced high production of different IgG subclasses, but despite similar IgG1 titers NPX-vaccinated mice disclosed also higher IgG2a and IgG2b levels. The strong elicitation of the three IgG subclasses and the production of both Th1 and Th2-type cytokines such as IL-12p70, IFN-γ, IL-2, IL-6, and IL-10, confirmed the ability of NPX to induce a balanced Th1/Th2 response. Moreover, the different quality and quantity of IgG subclasses, and their superior ability to recognize rHER2/neu in its native conformation likely reflected on the better functionality of NPX-induced antibodies in triggering complement-mediated specific lysis of rHER2/neu-positive cells. Interestingly, NPX not only induced humoral responses that persisted over time, but also selected mature B cell clones secreting antibodies with an improved ability to bind rHER2/neu in its native conformation and to mediate effector functions. The robust immune responses induced by NPX proved to be effective in both the prophylactic and therapeutic settings; indeed, NPX-adjuvanted vaccine formulation prevented and significantly delayed tumor growth in tumor challenged mice. Interestingly, antitumor responses seemed in part to be mediated by NPX ability to induce also CTL responses, which were detected only in NPX-vaccinated groups. Finally, while both alum- and NPX-adjuvanted vaccines proved to be successful in breaking tolerance against rHER2/neu in BALB-neuT transgenic mice, NPX-vaccinated mice displayed IgG titers that were two-fold higher than those observed with alum. Interestingly, in transgenic mice NPX vaccination resulted in a better Th1/Th2 balance than in BALB/c mice. However, only NPX-induced antibodies were able to recognize rHER2/neu in its native conformation. This likely explains the capacity of NPX-based vaccination to protect from or delay the growth of spontaneous tumors in BALB-neuT mice, whereas alum completely failed to induce any protective response. Taken together, our data show that NPX is a safe and powerful adjuvant that could be exploited for the development of new HER2/neu vaccination strategies. In fact, NPX is effective in enhancing the magnitude, breadth, quality, and longevity of specific humoral and cellular immune responses to antigens, without causing toxicity. Importantly, these effects can be achieved even with a strongly reduced antigen dose.L’utilizzo di proteine o peptidi come immunogeni ha sempre rappresentato un’attrattiva per la creazione di vaccini, in particolare per i vaccini a scopo antitumorale; ciononostante, questo genere di formulazione richiede l’impiego di adiuvanti immunologici efficienti e sicuri che siano in grado di potenziare la scarsa immunogenicità degli antigeni stessi. Sebbene dozzine di adiuvanti si siano dimostrate efficienti in ambito preclinico e clinico, l’allume rimane il principale adiuvante ad uso umano impiegato in tutto il mondo, nonostante abbia dimostrato scarsa efficienza nell’ambito della vaccinazione antitumorale. I prerequisiti di un adiuvante antitumorale sono di fatto diversi da quelli dei classici adiuvanti. I vaccini antitumorali hanno infatti come target antigeni self, e dunque l’adiuvante antitumorale deve essere abbastanza potente da superarne la tolleranza immunologica, ma deve anche essere sicuro in modo da evitare fenomeni avversi di tipo autoimmune. Studi recenti hanno dimostrato che affinché i vaccini tumorali preventivi e terapeutici siano efficaci, si devono indurre risposte sia di tipo T helper 1 (Th1) che Th2, in grado di indurre sia una forte attività litica da parte dei linfociti CD8+ T citotossici (CTL) che la produzione di sottoclassi anticorpali capaci di mediare particolari funzioni effettrici. Ad esempio, nel topo è stata dimostrata una correlazione tra prevenzione tumorale e presenza di alti livelli di immunoglobuline IgG2a e IgG2b, considerate le più efficienti nell’induzione di citotossicità complemento-dipendente (CDC) e di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC). Per adempiere a tutte queste richieste, le nuove generazioni di vaccini spesso incorporano nella propria formulazione degli agonisti dei toll-like receptors (TLRs). Tra questi agonisti, i polimeri naturali (NP), che agiscono come damage-associated molecular patterns (DAMPs) o pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), stanno emergendo come una nuova classe di efficienti adiuvanti immunologici grazie alla loro capacità di mediare l’interazione tra il sistema immunitario innato e adattativo. In particolare, essi sono in grado di indurre la maturazione delle cellule dendritiche (DCs) e di regolare accuratamente il bilancio tra le risposte di tipo Th1 e Th2, al fine di indurre potenti e durature risposte umorali e cellulari. Gli NP sono inoltre biocompatibili, biodegradabili, non tossici, non immunogenici e non infiammatori. Questo progetto di ricerca si è focalizzato sulla validazione del polimero naturale da noi sviluppato, cui ci riferiamo col termine NPX a causa di vincoli brevettuali, come nuovo agonista di TLR e veicolo di immunogeni per la creazione di vaccini antitumorali più efficienti e sicuri, comparando il suo profilo di adiuvanticità con quello dell’allume. A questo scopo, abbiamo coniugato NPX con il dominio extracellulare (ECD) del recettore 2 per il fattore di crescita epidermico di ratto (rHER2/neu) o con peptidi a breve sequenza amminoacidica derivati dall’ECD stesso. I bioconiugati così sintetizzati sono stati utilizzati per la vaccinazione di topi BALB/c e di topi transgenici BALB-neuT. In questo lavoro abbiamo innanzitutto dimostrato che NPX possiede un profilo d’azione estremamente sicuro, in quanto i topi immunizzati con tale adiuvante non hanno manifestato segni di tossicità a livello locale. NPX si è inoltre rivelato estremamente efficiente nell’indurre forti risposte immunitarie antigene-specifiche. Infatti, sebbene entrambi gli adiuvanti abbiano stimolato con successo elevate risposte umorali contro rHER2/neu, i topi BALB/c immunizzati con NPX hanno prodotto titoli di IgG doppi rispetto a quelli riscontrati nel gruppo trattato con l’allume. Inoltre solo NPX è riuscito a indurre la produzione di anticorpi in risposta alla vaccinazione con peptidi derivanti dalla porzione extracellulare del recettore. Entrambi gli adiuvanti hanno prodotto alti livelli delle differenti sottoclassi di anticorpi IgG; tuttavia, nonostante la produzione di IgG1 sia paragonabile, i livelli di IgG2a e IgG2b sono risultati nettamente maggiori negli animali vaccinati con NPX. Le elevate concentrazioni delle tre sottoclassi anticorpali e la produzione di citochine sia di tipo Th1, quali IL-12p70, IFN-γ e IL-2, che di tipo Th2, come IL-6 e IL-10, hanno confermato la capacità di NPX di indurre una risposta Th1/Th2 bilanciata. La differente qualità e quantità degli anticorpi prodotti e la loro migliore capacità di riconoscere il recettore nella sua conformazione nativa, probabilmente si riflettono nella migliore funzionalità degli anticorpi indotti da NPX nell’attivare la lisi cellulare rHER2/neu-specifica mediata dal complemento. In particolare, NPX si è dimostrato efficace non solo nell’indurre risposte umorali durature, ma anche nel selezionare cloni maturi di linfociti B secernenti anticorpi dotati di una migliore capacità di riconoscere il recettore nella sua forma nativa e di mediare le proprie funzioni effettrici. Le elevate risposte immunitarie indotte da NPX si sono dimostrate efficienti nell’ambito sia della vaccinazione preventiva che terapeutica, prevenendo o ritardando in entrambi i contesti la crescita tumorale nei topi inoculati con il tumore. Tali risposte sembrano inoltre essere almeno in parte dovute all’azione dei CTL, la cui presenza è stata riscontrata solamente negli animali immunizzati con NPX. Sia la vaccinazione con NPX che quella con l’allume si sono dimostrate in grado di rompere la tolleranza contro il recettore espresso costitutivamente nei topi transgenici BALB-neuT. Il gruppo vaccinato con NPX ha prodotto titoli anticorpali doppi rispetto al gruppo allume e un profilo di risposta Th1/Th2 ancora più bilanciato rispetto a quanto osservato nei topi BALB/c. Comunque, solo gli anticorpi indotti da NPX si sono dimostrati capaci di riconoscere il recettore nella sua conformazione nativa, e ciò spiegherebbe come questo tipo di vaccinazione riesca a conferire protezione o indurre ritardo nella crescita tumorale spontanea nei topi BALB-neuT. Al contrario, la vaccinazione con l’allume ha completamente fallito nell’indurre una qualsiasi risposta tumorale protettiva. Nell’insieme, i risultati ottenuti indicano che NPX è un adiuvante sicuro ed efficace, potenzialmente utilizzabile per la creazione di vaccinazioni antitumorali HER2-specifiche. Abbiamo infatti dimostrato che NPX migliora l’entità, l’ampiezza, la qualità e la longevità delle risposte immunitarie umorali e cellulo-mediate rispetto all’allume, senza causare effetti tossici e permettendo inoltre di utilizzare dosi ridotte di antigene