Plant Food Allergens Purification and Characterisation of the Ses i 2 Major Allergen from Sesamum indicum Structure-Stability-Allergenicity Relationships of Native and Methionine-Oxidised Species

The term allergy is used to describe an abnormal immune response to harmless environmental substance (i.e., contact, ingestion and airborne allergens), that causes pathological symptoms in a predisposed subject. The pathophysiology of allergic responses involves a “sensitization phase”, that occurs immediately after exposure to the allergen, and "late phase reaction", which can substantially prolong the symptoms of the allergic response and result in tissue damage. Epidemiological data indicate that over 20% of the world population suffers from IgE-mediated allergic diseases caused by allergens from different sources. In particular, food allergies affect 2% of adults and up to 8% of the children under three years. Plant food allergens can be classified into families and superfamilies on the basis of their structural and functional properties. The most widespread groups of plant proteins is classified into seed storage proteins, that contain allergens are the cupin and prolamin superfamilies. The cupin superfamily includes allergenic seed storage proteins of the vicilin and legumin type present in soybeans, peanuts, and tree nuts. The prolamin superfamily includes several important types of allergens of legumes, tree nuts, cereals, fruits, and vegetables, such as the 2S albumin, the nonspecific lipid transfer proteins, and the cereal α-amylase and protease inhibitors. The 2S albumins are becoming of increasing interest in clinical research as they have been described as the major allergen in a number of plant foods. Although it is clear that food antigens, to produce allergy, must avoid intraluminal and intracellular degradation by proteases, reach immuno-competent cells in the intestinal lamina propria, circumvent immunological unresponsiveness and trigger specific IgE production, the path followed by many food allergens remains elusive. In addition we are lacking key information on the structural characteristic of food allergens that favour the development of an immune response rather than inducing tolerance (i.e., a TH1-type response). A substantial difference in the capacity to induce a specific immune response exists among antigen and immunogen. Antigenicity is the ability to combine specifically with the final products of the immune system (i.e., antibodies, and/or cell-surface receptor). Although all molecules that have the property of immunogenicity also have the property of antigenicity, the reverse is not true. Immunogenity is the ability to induce a humoral and/or cell-mediated specific response. Immunogenicity is not an intrinsic property of an antigen but rather depends on the particular biological system that the antigen encounters. In this work, we have studied the major allergen from sesame seed Ses i 2 (SwissProt code Q9XHP1), this allergen represents a suitable model to investigate the structural and conformational features associated to food allergens. In this study, we have purified sufficiently large amounts (10-30 mg) of Ses i 2 the major allergen from sesame seed (S. indicum) for subsequent chemical, conformational and stability characterization. Overall, we have collected chemical and structural data with the aim to define a homology structural model of Ses i 2. Our model shows a typical structural features of 2S albumins such as a four helical segments forming a compact hydrophobic core organised in a “up and down” architecture. The globular fold of Ses i 2 is stabilised by five disulfide bridges in particular, eight of the ten Cys-residues of Ses i 2 are conserved in prolamin superfamily. Ses i 2 manifests an extraordinary stability towards chemical and thermal denaturation in agreement with a strong resistance to proteolysis to the main gastrointestinal, blood, lysosomal and matrix proteases. These observations suggest that Ses i 2 can be absorbed in gut epithelium in intact form. At the light of these considerations the chemical derivatization of Ses i 2 with a fluorescent label such as fluorescein isothiocyanate was performed with the intent to explore the allergen cellular uptake by immunohistochemical analysis. Ses i 2-[F] was incubated with Caco-2 cell line that in specific culture conditions is able to form a monolayer similar to gut epithelium. Collected data demonstrate that Ses i 2 is absorbed by an endocytosis uptake pathway and this finding associated with the resistance to lysosomal enzymes suggests that Ses i 2 may interact in intact form with dendritic cells in the lamina propria. Immunogenicity strongly depends by effectors of immune response that antigen encounters, in particular in the inflammation site the oxidative mechanisms could play a pivotal role in antigen degradation processing. In inflammation sites, H2O2 and HOCl are the major oxidants produced and they are highly reactive with the proteins in which methionine is one of the most oxidant-sensitive amino acid residues. Strikingly, Ses i 2 amino acids sequence is particularly abundant in Met-resiudes (~16%) thus during this work we investigated the structural consequences of oxidative damage that occurs in several pathological states in which inflammatory processes are involved. Methionine residues in Ses i 2 are selectively oxidized in the presence of H2O2 and the myeloperoxidase system. In our study, we demonstrated that Ses i 2 is strongly stabilized by a hydrophobic core characterised by nine methionine residues, this observation is in agreement with the dramatic structural and conformational alterations induced by the selective oxidation of Met residues of Ses i 2. The strong effect of oxidation on stability properties of Ses i 2 suggested an involvement of the oxidative mechanism in the modulation of immune response. In the site of immune response, oxidation of protein allergens may represent a critical step in tissue defence, immunospecific response and allergic reactions. Alterations in this pathway in the oxidation step, followed by the proteolytic processing operated by immunocompetent cells might play a key role to induce allergic response. In order to confirm this hypothesis we have studied the effect on human DCs in the presence of native and oxidized protein. Surprisingly, Ses i 2 induces a strong production of IL-10 and a decrease in the IL-12p70 expression, that is the most important cytokine in the develop of Th1 response. Conversely, Ses i 2-ox is not able to rise the expression of IL-10 and this behaviour is correlated with a strong enhancement in the production of IL-12p70. Ses i 2 and Ses i 2-ox show a low capacity to stimulate the expression of co-stimulatory molecules CD80 and CD86, while HLA is up-regulated in the presence of Ses i 2-ox. Overall the data suggest that Ses i 2 is no able to induce a Th1 response, while Ses i 2-ox through the dual stimulation of IL-12p70 and HLA expression is able to produce a Th1 “self-response”. These results corroborate the hypothesis whereby the oxidative damage and proteolytic process are strongly correlated to determine the immunogenicity of an antigen. Finally, we used the x-ray crystallography approach with the aim to solve the crystal structure of Ses i 2. In our trials we obtained small crystals of Ses i 2 and preliminary diffraction data have been measured. Unfortunately, the quality of the data was not good enough to allow us to determine the structure of the Ses i 2 allergen.Il termine allergia viene utilizzato per indicare una reazione immunitaria esagerata dell’organismo contro una sostanza innocua presente nell’ambiente, (quali sono gli allergeni da contatto, da ingestione e da inalazione), la quale causa sintomi patologici in soggetti predisposti. La fisiopatologia della risposta allergica coinvolge una fase detta di sensibilizzazione che si sviluppa immediatamente dopo la prima esposizione all’allergene ed una fase tardiva nella quale vengono sostanzialmente prolungati i sintomi della risposta allergica con conseguente danno tissutale. I dati epidemiologici indicano che più del 20% della popolazione mondiale soffre di malattie allergiche IgE-mediate causate da allergeni di diversa origine. In particolare, l’allergia alimentare affligge il 2% della popolazione mondiale adulta e circa l’8% della popolazione mondiale al di sotto dei tre anni di vita. Gli allergeni da piante sono classificati in famiglie e superfamiglie proteiche sulla base delle loro caratteristiche strutturali e conformazionali. Il gruppo più diffuso di proteine vegetali è classificato nelle seed storage proteins in cui si possono ritrovare gli allergeni della superfamiglia delle cupine e delle prolamine. La superfamiglia delle cupine include le proteine allergeniche di accumulo nei semi della classe delle viciline e legumine presenti nella soia, nelle arachidi e noci. La superfamiglia delle prolamine include molti importanti allergeni nei legumi, nelle noci, cereali, frutta e verdura, i quali sono suddivisi nelle classi delle: 2S albumine, nonspecific lipid transfer protein, α-amilasi dei cereali e inibitori delle proteasi. La ricerca clinica ha dimostrato interesse crescente per la classe delle 2S albumine le quali sono state descritte come allergeni maggiori in un numero elevato di piante alimentari. Chiaramente gli allergeni alimentari, per indurre risposta allergica, devono evitare i processi proteolitici intraluminali ed intracellulari e raggiungere le cellule immunocompetenti nella lamina propria, ma i meccanismi mediante i quali gli allergeni aggirano il fenomeno di tolleranza e inducono la produzione di IgE specifiche sono ancora sconosciuti. Inoltre, mancano informazioni chiave sulle caratteristiche strutturali degli allergeni alimentari che risultano essere determinanti nello sviluppo di una risposta immunitaria piuttosto che dei meccanismi di tolleranza. Esiste una sostanziale differenza nella capacità di indurre una risposta immunitaria specifica tra un antigene ed un immunogeno. L’antigenicità è l’abilità di una sostanza di combinarsi in modo specifico con i prodotti finali del sistema immunitario (anticorpi e/o recettori di membrana). Sebbene tutte le molecole immunogene possiedano proprietà antigeniche non è possibile affermare il contrario, infatti, l’immunogenicità è definita come l’abilità di una sostanza detta immunogeno di indurre una risposta specifica umorale e/o cellulo-mediata. L’immunogenicità non è una proprietà intrinseca di un antigene, ma dipende dal sistema biologico con cui l’antigene stesso entra in contatto. In questo lavoro abbiamo studiato l’allergene maggiore da semi di sesamo Ses i 2 (Q9XHP1) che rappresenta un modello adeguato per investigare le caratteristiche strutturali e conformazionali associate agli allergeni alimentari In questo lavoro, abbiamo purificato in quantità sufficiente (10-30 mg) l’allergene maggiore da semi di sesamo (S. indicum) Ses i 2 per successivi studi strutturali e conformazionali. Durante i nostri studi sono stati ottenuti una grande quantità di dati chimici e strutturali che sono confluiti in un modello strutturale per omologia di Ses i 2. Il modello mostra la tipica struttura delle 2S albumine con quattro segmenti alpha-elicoidali a formare un core idrofobico compatto organizzato in una architettura up-and-down. La struttura globulare di Ses i 2 è stabilizzata da cinque ponti disolfuro, in particolare otto residui di Cys sono conservati nella famiglia delle prolamine. Ses i 2 mostra, inoltre una straordinaria stabilità verso la denaturazione chimica e termica, associata a una forte resistenza alla proteolisi dei principali enzimi gastrointestinali, lisosomiali, di matrice e della coagulazione. Queste osservazioni permettono di ipotizzare un assorbimento della proteina in forma intatta a livello intestinale. Alla luce di queste considerazioni la derivatizzazione chimica di Ses i 2 con un label fluorescente come la fluoresceina isotiocianato è stata eseguita con l’intento di esplorare l’internalizzazione cellulare dell’allergene mediante analisi di immunofluorescenza. Per evidenziare l’internalizzazione cellulare, il coniugato Ses i 2-[F] è stato incubato con cellule Caco-2, che in specifiche condizioni formano un mostrato simile all’epitelio intestinale. I dati raccolti dimostrano che Ses i 2 viene assorbito attraverso un processo endocitotico e questa informazione associata alla resistenza agli enzimi lisosomiali permette di ipotizzare una interazione di Ses i 2 in forma intatta con le cellule dendritiche nella lamina propria. L’immunogenicità è fortemente dipendente dagli effettori che l’antigene incontra, in particolare nei siti di infiammazione i processi ossidativi giocano un ruolo fondamentale nella degradazione dell’antigene. Nei siti dell’infiammazione, H2O2 e HOCl sono i principali ossidanti prodotti e possiedono l’abilità di reagire con una vasta gamma di macromolecole e nelle proteine il residuo amminoacidico più sensibile all’ossidazione è la metionina. Sorprendentemente, la sequenza amminoacidica di Ses i 2 è particolarmente abbondante in Met (circa 16%), quindi in questo lavoro abbiamo investigato le conseguenze strutturali del danno ossidativo che si sviluppa in molte condizioni patologiche nelle quali è coinvolta l’infiammazione. I residui di metionina sono stati selettivamente ossidati in presenza di H2O2 ed del sistema mieloperossidasico. In questo lavoro, abbiamo dimostrato che Ses i 2 è fortemente stabilizzata da un core idrofobico di 9 Met, questa osservazione è risultata essere in stretto accordo con la drammatica alterazione strutturale e conformazionale indotta dall’ossidazione selettiva dei residui di Met in Ses i 2. Il forte effetto dell’ossidazione sulla stabilità di Ses i 2 ha suggerito un coinvolgimento del meccanismo ossidativo nella modulazione della risposta immunitaria. Nel sito della risposta immunitaria, l’ossidazione delle proteine allergeniche può rappresentare un passaggio critico nella difesa tissutale, nella risposta immunospecifica e nella risposta allergica. Alterazioni in questo meccanismo a livello dei processi ossidativi seguiti dai processi proteolitici operati dalle cellule immunocompetenti potrebbero giocare un ruolo chiave nell’indurre la risposta allergica. Per confermare questa ipotesi abbiamo studiato l’effetto di Ses i 2 e Ses i 2-ox su cellule dendritiche umane. Sorprendentemente, Ses i 2 induce una forte produzione di IL-10 con una diminuzione nell’espressione di IL-12p70, la più importante citochina nello sviluppo della risposta Th1. Contrariamente, Ses i 2-ox non è in grado di aumentare l’espressione di IL-10 e questo è correlato con la forte produzione di IL-12p70 da parte delle DCs. Ses i 2 e Ses i 2-ox hanno dimostrato un scarsa capacità di stimolare l’espressione delle molecole co-stimolatorie CD80 e CD86, mentre HLA è aumentato in presenza di Ses i 2-ox. Nell’insieme questi dati suggeriscono che Ses i 2 non è in grado di indurre una risposta Th1, mentre Ses i 2-ox, stimolando la produzione di IL-12p70 e l’espressione di HLA è capace di indurre una risposta Th1-self. Questi risultati sostengono l’ipotesi che il danno ossidativo e la processazione proteolitica di una antigene siano fortemente correlati nel determinarne l’immunogenicità. Da ultimo, abbiamo utilizzato la cristallografia a raggi-X con l’intento di risolvere la struttura di Ses i 2. Durante i nostri studi sono stati ottenuti cristalli che sottoposti a misurazione hanno fornito dei set di dati di diffrazione, ma al momento non hanno permesso una analisi strutturale completa della proteina