Rapid and selective capture of nucleic acids using carbon nanotubes

Gene therapy is raising as one of the most promising options for treating genetic and acquired disorders. However, recombinant plasmid DNA (pDNA) must be recovered from complex extracts with a diversity of biomolecules that share similar characteristics and properties. Moreover, those biomolecules can cause immunogenicity, and their removal is a fundamental prerequisite in preparing high-purity, stable, and biological active pDNA for therapeutic application. To respond to this challenge and isolate pDNA from complex extracts, a promising alternative is proposed, based on using carbon nanotubes (CNTs). In recent years, biological applications of CNTs have been explored, motivated by their interesting size, shape, structure, biocompatibility, and high affinity for biomolecules. In this work, an effective method to isolate pDNA was developed, using multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) to capture proteins and other contaminating nucleic acids, like RNA and genomic DNA (gDNA). MWCNTs with different diameters were evaluated, while mixtures of RNA and pDNA were prepared to address the selectivity of the material. The results of this work evidenced the ability of MWCNTs to capture RNA from complex samples, enabling the clarification of pDNA. The results also demonstrated that MWCNTs can reduce the amount of impurities in the first cycle of extraction, reducing about half of the proteins, and significantly reducing the levels of genomic DNA in solution, with a pDNA recovery rate of 86%. When performing up to three consecutive cycles, the purity of soluble pDNA can be significantly improved. To further reduce the environmental impact of this technology, the possibility of recycling CNTs has also been confirmed, as well as it was assured the safety on their use by verifying the biocompatibility of this material. Thus, attained results demonstrate the development of a simple, efficient, and reliable method for rapid purification of pDNA biopharmaceuticals.A terapia genética tem-se destacado como uma das opções mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas e adquiridas. Para isso, o DNA plasmídico recombinante (pDNA) deve ser recuperado de extratos complexos cuja composição compreende uma alta diversidade de biomoléculas que partilham características e propriedades semelhantes. Além disso, estas biomoléculas podem causar imunogenicidade, aquando da administração, sendo a sua remoção um pré-requisito fundamental na preparação de pDNA estável, de alta pureza e biologicamente ativo para aplicação terapêutica. Consequentemente, a purificação de pDNA é um processo muito dispendioso para a indústria farmacêutica, e apresenta também um grande impacto para o ambiente, devido ao uso de solventes orgânicos e sais. Para responder a este desafio e isolar o pDNA de extratos complexos, é proposta uma alternativa promissora, baseada no uso de nanotubos de carbono (CNTs). Devido à sua versatilidade, os CNTs têm sido amplamente explorados em diversas áreas, sendo que, as suas propriedades únicas, como o tamanho, forma, estrutura, biocompatibilidade e elevada afinidade por biomoléculas levaram a que nos últimos anos tenham também ganho muita relevância para aplicações biológicas. Neste âmbito, o presente trabalho descreve o desenvolvimento de um método eficaz para isolar o pDNA a partir de um lisado complexo de Escherichia coli, utilizando nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) para capturar proteínas e outros ácidos nucleicos contaminantes, como RNA e DNA genómico (gDNA). Primeiramente, foram avaliados diferentes diâmetros de MWCNTs (<10 nm,