Recombinant proteins in differentiation of stem cells

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016A utilização de cardiomiócitos derivados de células estaminais embrionárias (ESC) permite-nos acesso a um grande número de células para investigação biomédica e uso de fármacos ou ensaios toxicológicos. Apesar de ser possível aumentar a eficiência de diferenciação através de manipulação genética sobre expressando fatores cardíacos específicos, os protocolos atuais são bastante morosos, têm baixo rendimento e são dificilmente reprodutíveis. A transdução proteica é um método alternativo para aumentar a eficácia de diferenciação de células estaminais embrionárias em cardiomiócitos. O objetivo consistiu na construção de uma proteína quimérica com a capacidade intrínseca de transdução celular. Produzimos e purificámos esta proteína recombinante, com a capacidade de atravessar a membrana celular, sendo composta por dois domínios: a proteína humana CITED2, ligada através do domínio terminal-N a um Domínio de Transdução Proteica (PTD), rico em argininas, que confere a capacidade de transduzir proteínas biologicamente ativas e entregá-las no interior da célula. Com este trabalho, conseguimos demonstrar que esta proteína recombinante CITED2, quando adicionada ao meio de cultura celular, atravessa a membrana celular, alcança o núcleo, e é funcional. Em células embrionárias de ratinho (mESC), o knockout do gene Cited2 leva à diferenciação destas células em cardiomiócitos. A suplementação com a proteína recombinante CITED2, no segundo dia de diferenciação, no meio de cultura em que as células tinham sofrido a depleção de Cited2, tem a capacidade de compensar os defeitos na diferenciação cardíaca. Por outro lado, se o meio de cultura for suplementado na fase inicial de diferenciação (dia 0), enquanto as células ainda se encontram num estado de pluripotência, sugere um atraso no processo de diferenciação geral. Apesar de serem necessários estudos mais aprofundados, a aplicação direta da proteína desenvolvida parece ter a capacidade de substituição dos efeitos causados pela proteína endógena, sugerindo assim que a proteína CITED2 desempenha um papel importante tanto em cardiogénese como em pluripotência