Modelos in vitro para rastreio de fármacos

Cancer is the main target of research in the field of biology and pharmacology. Every year, thousands of cancer-related articles are published in specialized scientific journals. The development of new anticancer therapies is also one of the main interests of pharmaceutical companies. However, academia and big pharma have recently set their sights on cutting expenses related to drug development through co-operation protocols. Currently, various cellular viability assays (kits) are available in the market. However, most of these kits are expensive. To fulfill this need, there is a crescent demand for new protocols, such as cellular viability and cytotoxicity assays, that can be used for drug development in a faster and cheaper manner. In the present study, the application of Crystal Violet (CV), a compound that is relatively cheap, to determine the cellular viability of breast cancer and cervical cancer cells was evaluated. As no uniform and/or optimized CV cellular viability assay has been described in literature, the main focus of this work was the optimization procedure of a CV protocol, and its application for high-throughput screening (HTS) of new therapeutics. Two points of interest for the optimization of the protocol were considered: the possible fixation of cells and the concentration of the CV solution used for cell staining. The obtained results show there is an increase in absorbance proportional to the number of seeded cells for all CV protocol variations. The optimization procedure was successful, as it was shown that fixing and staining cells with a CV solution of higher concentration increased sensibility and decreased the variance of the signal/cell ratio in comparison with other tested protocols. It was also shown that the optimized CV assay may also be used as an alternative method for drug efficacy screening to other cellular viability assays widely described in literature, such as the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Resazurin assays. It was also observed that the optimized CV assay may be applied for HTS of new anticancer drugs. Overall, as CV is a compound that is cheap to acquire, it may be used during anticancer drug development in the future.As doenças do foro oncológico são certamente o principal foco de investigação na área da biologia e da farmacologia. Por conseguinte, todos os anos são publicados milhares de artigos relativos a este tema em revistas da especialidade. O desenvolvimento de novas terapêuticas para tratamento do cancro é também do interesse das empresas farmacêuticas. Contudo, até aos dias de hoje, o custo associado ao desenvolvimento de fármacos continua muito elevado. Deste modo, as instituições académicas e as grandes empresas farmacêuticas têm vindo a estabelecer colaborações que visam a diminuição destes custos, nomeadamente os que incluem as despesas dos ensaios pré-clínicos. Atualmente existem vários ensaios de viabilidade celular em forma de kit que são usados durante os ensaios pré-clínicos. Contudo, a maioria destes kits são dispendiosos, o que tem despoletado uma necessidade crescente de desenvolver novos ensaios, que permitam avaliar o efeito terapêutico de novos fármacos com maior celeridade e menor custo. No presente estudo foi investigada a aplicação do Cristal Violeta (CV), um corante pouco dispendioso, para determinar a viabilidade celular de células cancerígenas do colo do útero e da mama. Uma vez que não existe qualquer ensaio padronizado e/ou otimizado para o uso deste composto para a determinação da viabilidade celular descrito na literatura, o principal foco deste trabalho passou pela otimização de um protocolo utilizando o CV para futura avaliação em larga escala (HTS) de fármacos. Durante a otimização do protocolo de CV para determinação da viabilidade celular foram considerados os seguintes pontos: fixação ou ausência de fixação das células e a concentração da solução de CV utilizada para marcar as células. Os resultados obtidos demonstraram que há um aumento de absorbância do CV proporcional ao aumento do número de células para todas as variações do ensaio de CV. O protocolo em que se procedeu à fixação das células e em que foi usada uma solução mais concentrada de CV foi escolhido como sendo o protocolo otimizado, i.e., mais adequado para determinar a viabilidade celular, uma vez que este demonstrou maior sensibilidade, precisão e menor variabilidade no rácio sinal/célula nos resultados obtidos. O ensaio otimizado de CV também permitiu avaliar a eficácia de um fármaco (Doxorubicina (DOX)) de forma semelhante a outros ensaios amplamente descritos na literatura, tal como é o caso do ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e o da Resazurina. Foi ainda verificado que o ensaio otimizado de CV pode ser aplicado para HTS de novos fármacos. Em conclusão, sendo o CV um composto de baixo custo, este poderá possivelmente ser usado futuramente na investigação de fármacos para tratamento do cancro