In vitro tumor models for cancer research and therapeutics evaluation

Spheroids have emerged as in vitro models that are able to reproduce the biological and architectural microenvironment of human tumor tissues, which make them promising platforms for cancer research purposes. Several techniques have been used in the for spheroids analysis, such as scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), flow cytometry and fluorescence microscopy. Despite their intrinsic properties, their analysis through fluorescence microscopy, namely by confocal laser scanning microscopy (CLSM), can be very challenging due to the thickness of the spheroids as well as the light scattering phenomenon, that limits the penetration of light within the spheroids. To overcome this obstacle, several optical clearing methods have been recently explored to rend spheroids with enhanced transparency by homogenizing the refractive index (RI) of their cellular and acellular constituents, and subsequently improve the light penetration within the spheroids. Herein, it was evaluated for the first time the influence of performing the immersion of spheroids in the ClearT and ClearT2 optical clearing solutions using different incubation conditions (static, horizontal agitation and rotatory agitation), on their imaging by CLSM. Overall, the best results were obtained for those spheroids treated with both ClearT and ClearT2 under rotatory agitation. Such condition allowed the best imaging of the propidium iodide (PI) fluorescence in the Z-axis and in the spheroids’ interior. Also, ClearT demonstrated to be more suitable to perform the analysis of spheroids’ interior, while ClearT2 allowed to obtain higher PI fluorescence intensity and PI signal depth in the Z-axis. In conclusion, this work can trigger the development of new pathways for cancer therapy.Os esferóides surgiram como um modelo in vitro capaz de reproduzir fielmente a biologia e a arquitetura dos tecidos tumorais humanos. Estas características fazem deles plataformas promissoras para a investigação do cancro. Técnicas como a microscopia eletrónica de varrimento, microscopia eletrónica de transmissão, citometria de fluxo e microscopia de fluorescência têm sido usadas para analisar esferóides. As propriedades intrínsecas dos esferóides fazem com que a sua a análise por microscopia de fluorescência (p.ex. microscopia confocal de fluorescência) seja desafiante devido ao fenómeno de dispersão da luz, que por sua vez limita a penetração da luz nos esferóides. De forma a ultrapassar estas limitações, têm sidos usados vários métodos de clareamento ótico para homogeneizar o índice de refração (IR) dos constituintes dos esferóides. Estes procedimentos têm permitido desta forma uma maior penetração da luz nos mesmos. No presente estudo, foram investigados pela primeira os métodos de clareamento ClearT e ClearT2 aplicados em esferóides usando diferentes condições de imersão (sem agitação, agitação horizontal, agitação rotatória) de forma a avaliar a sua implicação na aquisição de imagens de microscopia confocal de fluorescência. Os resultados obtidos permitem concluir que a agitação rotatória permitiu a aquisição das imagens com um maior sinal de fluorescência do iodeto de propídio (IP) no eixo do Z, assim como no interior dos esferóides. Por outro lado, os resultados demonstraram que o método ClearT permite visualizar melhor o interior dos esferóides, enquanto que o método ClearT2 permite obter imagens com maior intensidade de fluorescência de IP e a maiores distâncias no eixo do Z. Com base nos resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir que a optimização do ClearT e do ClearT2 , permitindo o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o cancro. Estas técnicas facilitam a análise de esferóides através do uso de microscopia confocal de fluorescência, como por exemplo, a morte celular induzida através da administração de agentes terapêuticos