Effects of chemotherapy and radiotherapy in rectal cancer : significance of different cellular outcomes in tumor behavior

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatalógicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2015Rectal cancers comprise 35% of all diagnosed colorectal cancers (CRC), being the third most common among gastrointestinal cancers. Despite the benefits of neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT), 5-fluorouracil (5-FU)-based regimens plus radiotherapy (RT), 15-20% of patients suffer from relapse. Pathological staging remains the most important prognostic factor in rectal cancer and the search for new prognostic and predictive biomarkers is fundamental. DNA damaging agents and ionizing radiation used in the therapy of human cancers may induce senescence of cancer cells. Senescent cells exhibit a secretory phenotype that can affect cancer cell behavior and, eventually, clinical prognosis. In this work we hypothesize that neoadjuvant CRT-induced cellular senescence may affect rectal cancer relapse. To experimentally test our hypothesis, we cultured colon cancer cells induced into senescence by exposure to 5-FU or doxorubicin. SAS-media were enriched in IL-8, TGF-α, VEGF, cystatin C, LCN2, MIF, EMMPRIN, and uPAR, and exerts a positive effect on the proliferation of cycling colon and rectal cancer cells. SAS-medium was capable of paracrine induction of epithelial-to-mesenchymal (EMT) transition in colon and rectal cancer cell lines, of increased cell invasion in vitro, and of increased chemosensitivity to 5-FU. Moreover, we found that in rectal cancer samples from patients treated with neoadjuvant CRT tumor cell niches enriched for senescent cells bookmark regions of increased expression of EMT-related genes (slug, snail, vimentin) when compared to nearby senescent-null control regions. We provide evidences that therapy-induced senescent cancer cells influence the tumor microenvironment by promoting EMT via short range interactions. Next, to relate neoadjuvant CRT-induced cellular senescence with rectal cancer relapse, we retrospectively studied rectal cancers from 35 patients treated with neoadjuvant therapy. Data showed no correlation between the senescence markers p16INK4a and p21WAF1 and relapse, and it was not possible to validate a method for senescence detection in formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) samples. Altogether, our findings showed that secretomes from senescent colon cancer cells may induce effects with opposite prognostic value. Prospective studies shall clarify whether, after neoadjuvant therapy, the presence of senescent cells add prognostic power on cancer recurrence and patient survival.O cancro do reto representa cerca de 35% de todos os tumores colo-retais (CCR) diagnosticados, sendo o terceiro mais comum entre os tumores gastrointestinais. Apesar da melhoria significativa no contexto da terapia neoadjuvante, 5-fluorouracil (5-FU) em concomitância com radioterapia (RT), as taxas de recidiva permanecem elevadas, cerca de 15-20%. O estadiamento histo-patológico permanece o principal fator de prognóstico sendo fundamental a pesquisa de novos biomarcadores de prognóstico. No tratamento da doença oncológica, a terapêutica com citostáticos e radiação pode induzir senescência cujo fenótipo secretor é conhecido por senescence-associated secretory phenotype (SASP), capaz de modificar o micro-ambiente e contribuir para a progressão tumoral. Este trabalho teve por base a hipótese de que a senescência celular induzida pela quimioterapia (QT) pode estar correlacionada com a recidiva em doentes com cancro do reto em estadio avançado. Para testar experimentalmente esta hipótese foi induzida senescência em células de cancro do cólon (HCT 116) por exposição ao 5-FU ou doxorrubicina. A análise dos meios condicionados obtidos (SAS-media) revelou a presença dos compostos IL-8, MIF, VEGF, uPAR, EMMPRIN, cistatina C, lipocalina-2 e TGF-α, que se verificou estimularem a proliferação de células de cancro do cólon e reto não senescentes. SAS-medium induziu também um aumento significativo da expressão de marcadores moleculares de transição epitélio-mesênquima (TEM), do potencial invasivo em células tumorais não senescentes, e da quimio-sensibilidade, o que sugere um duplo efeito nas células tumorais não senescentes. Em amostras humanas de tumores do reto verificamos um aumento da expressão de marcadores mesenquimais em zonas tumorais associadas à presença de células senescentes, constituindo uma forte evidência de que a senescência induzida pela QT influencia de facto o micro-ambiente tumoral, promovendo a TEM. Para determinar uma possível correlação entre a presença de células senescentes e a recidiva no cancro do reto, realizámos um estudo retrospetivo envolvendo 35 amostras de doentes submetidos a terapia neoadjuvante. Os dados obtidos não permitiram estabelecer uma correlação entre os marcadores de senescência p16INK4a e p21WAF1 e a recidiva, não tendo sido possível validar um método que consideremos adequado para a identificação de células senescentes em amostras fixadas. Em conclusão, os dados obtidos neste trabalho sugerem que o secretoma de células epiteliais tumorais pode induzir fenómenos com valor prognóstico opostos. Estudos prospetivos futuros irão contribuir para clarificar o papel da senescência celular na definição de novos critérios de prognóstico e identificação de novos alvos terapêuticos.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), SFRH/BD/45219/200