Dynamiques cellulaires et régulation génétique de la morphogenèse du poisson zèbre

Au cours du développement embryonnaire, le cerveau est classiquement divisé en trois unités fonctionnelles et anatomiques, à savoir le cerveau antérieur, moyen et postérieur. Le cerveau postérieur utilise la segmentation comme stratégie pour organiser les nerfs crâniens et les flux de cellules de la crête neurale. La segmentation transitoire du cerveau postérieur conduit à 7/8 unités cellulaires répétées le long de l'axe antéro-postérieur (AP) appelés rhombomères (r). Ce processus conservé au cours de l’évolution établit le plan de la tête des vertébrés. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la segmentation du cerveau postérieur ont été largement étudiés. Notre objectif est d'étudier la formation des r au niveau cellulaire chez le poisson zèbre, un modèle vertébré star de la biologie. Nous avons besoin de la carte précise du destin et de la dynamique cellulaire qui mène du domaine des progéniteurs à l'organe. La carte actuelle du destin du système nerveux central du poisson aux stades précoce et tardif de la gastrula a été publiée en 1995. Elle a été obtenue par une reconstruction partielle du lignage grâce à un colorant fluorescent. La frontière précise des domaines de progéniteurs des r et les dynamiques cellulaire qui façonnent le cerveau postérieur sont inconnues. En utilisant l'imagerie par microscopie de pointe de poissons transgéniques et des outils de traitement d'image automatisés, nous avons reconstruit le lignage de r2-r6 de la mi gastrulation à la neurulation précoce. Nous fournissons une carte du destin plus fine et dynamique du cerveau postérieur de 6 à 15hpf. Les domaines de progéniteurs sont alignés le long des axes AP et dorso-ventral (DV) dès le stade du bouclier embryonnaire. Ils présentent une organisation AP parallèle à la marge du blastoderme. La ségrégation DV des r est établie par une distribution des progéniteurs le long de l'axe DV tel que ceux situés dans la partie dorsale du blastoderme vont former le domaine ventral des r. Notre étude donne un aperçu de l'origine clonale, de la prolifération cellulaire et des voies de migration des progéniteurs au cours de la mise en place du rhombencéphale.Nous avons exploré le rôle des voies de signalisation de l'acide rétinoïque (AR) et du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) dans la morphogenèse du cerveau postérieur. On pense que les gradients des morphogènes AR et FGF spécifient et modèlent les ébauches du cerveau postérieur en sept segments d’identités distinctes. L'inhibition de l’AR à l’aide de drogue entraîne une perte progressive des r postérieurs, dépendante de sa concentration. De même, il y a une perte d'expression de leurs marqueurs moléculaires. On suppose que l'expansion des r antérieurs se fait au détriment des postérieurs. Nous ne savons pas comment la morphogenèse des domaines de progéniteurs conduit à ce défaut. Nous avons établi la carte dynamique du destin du cerveau postérieur de l’embryon AR nul. L’organisation des domaines de progéniteurs est en correspondance avec la position et la taille des segments modifiés, i.e. l'expansion des domaines des progéniteurs antérieurs. De plus, le mouvement de convergence des cellules est retardé ce qui est une conséquence précoce du gradient AR altéré. Il en résulte des accumulations ectopiques de progéniteurs neuraux et des anomalies du tube neural. Notre phénotype rappelle celui du mutant trilobite de Vangl2 acteur dans la voie de signalisation de polarité cellulaire planaire (PCP). Il a été montré dans l'embryon de souris Raldh2-/- que le déficit en AR provoque une forte inhibition de Vangl2 et Fzd3 au niveau du cerveau postérieur et de la moelle épinière. Dans l'ensemble, nos données suggèrent que les défauts du tube neural dans l'embryon AR nul sont dus à l'altération de la signalisation PCP. De plus, nous avons démontré l’effet de communauté de l’AR sur les gènes cibles et la morphogenèse du cerveau postérieur par la restauration optogénétique du morphogène dans l’embryon vivant.The brain is often considered the most complex organ. During embryonic development, the brain is classically divided into three functional and anatomical units namely, fore, mid and hindbrain. Hindbrain, the posterior part utilises segmentation as a strategy to organise its diverse range of cranial nerves and the streams of neural crest cells. The transient segmentation of hindbrain leads to 7/8 repeated cellular units of segments in the antero-posterior axis (AP) called rhombomeres. Hindbrain segmentation patterns the head and is conserved among vertebrates. Molecular mechanisms that underlie hindbrain segmentation have been vastly investigated. We aim to study the formation of the rhombomeres at cellular level in zebrafish, a vertebrate model at the forefront of developmental biology. We need the precise fate map and the cell dynamics that lead from the progenitors’ domains to the organ. The current fate map of the zebrafish central nervous system (CNS) at early and late gastrula stages was published in 1995. It was obtained through sparse lineage tracing with a fluorescent dye. The precise border of the rhombomere progenitor domains and the cell dynamics that shape the hindbrain are unknown. Utilising advanced microscopy imaging of transgenic zebrafish lines and automated image processing tools, we developed a method to reconstruct the cell lineage of rhombomeres r2-r6 from mid-gastrulation through early neurulation. We provide a finer and dynamic fate map of zebrafish hindbrain from 6hpf till 15hpf. The rhombomere progenitor domains are aligned along the AP and dorso-ventral (DV) axes as early as the shield stage. Rhombomere progenitor domains exhibit AP organisation parallel to the blastoderm margin. The DV segregation of the rhombomeres is set by distribution of the progenitors along the DV axis at the shield stage. Progenitors located at the most dorsal part of the blastoderm will form the ventral domain of the rhombomeres. Our study gives insights into the clonal origin, cell proliferation and migration paths of hindbrain’s rhombomere progenitors throughout the early steps of the organ morphogenesis.We used our method to explore the role of the signalling pathways Retinoic acid (RA) and Fibroblast Growth Factor (FGF) in hindbrain morphogenesis. RA and FGF morphogen gradients are thought to specify and pattern the hindbrain primordia into seven segments with different identities. RA inhibition upon drug treatment leads to progressive loss of posterior rhombomeres in a concentration dependent manner. Concomitantly, there is a loss of expression of their molecular markers. It is presumed the expansion of anterior rhombomeres happens at the expense of the posterior ones. How the morphogenesis of the progenitor domains leads to this phenotypic defect is not known. We investigate the cellular events, cell proliferation and cell movements from the dynamic fate map under RA-null condition. We identified the progenitor domains whose organisation is in correspondence with the position and size of the modified segments i.e. the expansion of anterior progenitors’ domains. We also observed a delayed convergence movement that is an early consequence of the altered RA gradient. Consequently, it results in ectopic neural progenitor accumulations and neural tube defects. Our phenotype is reminiscent of the trilobite mutant of vangl2 that is a component of planer cell polarity (PCP) pathway. It was shown in mouse Raldh2-/- embryo that RA deficiency causes a strong downregulation of Vangl2 and Fzd3 at the level of hindbrain and spinal cord. Altogether our data suggests that neural tube defects in zebrafish RA-null embryo is due to the alteration in the PCP signalling. We demonstrated the community effect of RA signalling on target genes and hindbrain morphogenesis. Optogenetic restoration of RA in r5 progenitors at mid-gastrulation on one half of the embryo rescued the whole posterior rhombomere formation