Characterization of the role of CRMP4 in the semaphorin3E signaling pathway and fornix development

L'un des objectifs des neurosciences est d'élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse neuronale et conduisant à la mise en place de réseaux neuronaux. Au cours du développement embryonnaire, les neurones établissent entre eux des milliards de connexions via l’émission de dendrites et d’axones qui vont croitre rapidement grâce au cône de croissance situé à leur extrémité. Cette croissance est finement régulée, par les molécules de guidage rencontrées par le cône de croissance, mais dépend également du type de récepteurs pour ces molécules et des effecteurs intracellulaires propres au neurone. Notre laboratoire s’est intéressé à la post-commissure du fornix, un tract composé d’un ensemble d’axones de neurones du subiculum, appartenant à la formation hippocampique, et qui projettent dans les corps mamillaires de l’hypothalamus. La post-commissure du fornix appartient au système limbique et est impliqué dans la mémoire, la gestion des émotions et la navigation. L’altération de l’intégrité de cette post-commissure a été associée à des troubles psychiatriques ainsi qu’à des maladies neurodégénératives. Le développement de la post-commissure est sous le contrôle de la sémaphorine 3E (Sema3E), une molécule de guidage exerçant un effet attractif sur les neurones du subiculum via un complexe de récepteurs constitué de la plexine D1 (PlxD1), de la neuropiline 1 (Nrp1) et du VEGFR2. La liaison de la Sema3E sur la PlxD1 et la transduction du signal via le VEGFR2 induit le recrutement de la voie PI3K/Akt/GSK3β. Cependant les acteurs responsables, in fine, du remodelage du cytosquelette, essentiel pour permettre la croissance axonale, restaient à identifier. Les CRMP1, 2 et 4 ont été caractérisées au départ comme des acteurs de la signalisation sémaphorine 3A, dans laquelle elles régulent, entre autres, la croissance neuritique à travers leur capacité à agir sur le cytosquelette. Ces protéines peuvent en effet se lier avec l’actine et modulent également la dynamique des microtubules via leur déphosphorylation/phosphorylation par GSK3β dont elles sont un substrat. Ces différents éléments tendaient à faire des CRMP des candidats intéressants dont l’implication potentielle dans la signalisation Séma3E méritait d’être étudiée. Parmi ces trois CRMP, seule l’absence de CRMP4 dans des neurones issus du subiculum en culture bloque leur capacité à voir leur croissance axonale stimulée en présence de Séma3E. De plus l’analyse de la neuroanatomie d’embryons de souris CRMP4 révèle que ces animaux présentent à la naissance un développement anormal de la post-commissure du fornix et qui perdure à l’âge adulte. Une altération similaire de ce tract est présente chez des souris double hétérozygote CRMP4/Sema3E, montrant une interaction entre ces deux gènes et entérinant le lien entre CRMP4 et Sema3E in vivo. De manière surprenante, CRMP4 interagit avec le complexe de récepteurs de PlxD1/Nrp1/VEGFR2 seulement à l’intérieur de microdomaines membranaires ayant une composition lipidique particulière et déjà caractérisés dans des mécanismes de guidage, les DRM (detergent resistant membrane). L’ajout de Sema3E sur des neurones du subiculum en culture a permis de mettre en évidence l’inhibition de la phosphorylation de CRMP4, en aval de la voie Akt/GSK3β. De plus nous avons montré que l’intégrité des DRM de même que le domaine de liaison de CRMP4 au cytosquelette étaient nécessaires à l'activité stimulatrice de croissance de la Sema3E, suggérant un rôle pour CRMP4 à l'interface entre les récepteurs de la Sema3E membranaires et le réseau du cytosquelette. Ces différents résultats mettent en évidence le rôle essentiel de CRMP4 dans la signalisation Sema3E conduisant au développement du fornix et contribue à apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'établissement spécifique des connexions neuronales au cours de la mise en place en place du cerveau.One of the goals of neurosciences is to elucidate the molecular mechanisms involved in neuronal morphogenesis and leading to the establishment of neuronal networks. During embryonic development, neurons establish billions of connections between themselves via the emission of dendrites and axons that will grow rapidly through growth cones located at their tips. This growth is finely regulated by the guidance molecules encountered by the growth cone but also the type of receptors at the surface of the cell as well as the intracellular effectors that can be specific to certain types of neurons. Our laboratory was interested in the post-commissure of the fornix, a tract composed of a set of axons from neurons located in the subiculum, belonging to the hippocampal formation, that project into the mammillary bodies of the hypothalamus. The post-commissural fornix belongs to the limbic system and is involved in memory, emotion management and navigation. Alteration of the integrity of this post-commissure has been associated with psychiatric disorders and neurodegenerative diseases. The development of the post-commissure is under the control of semaphorin 3E (Sema3E), a guidance molecule exerting an attractive effect on subiculum neurons via a receptor complex consisting of plexin D1 (PlxD1), neuropilin 1 (Nrp1) and VEGFR2. Sema3E binding to PlxD1 and signal transduction via VEGFR2 induces the recruitment of the PI3K/Akt/GSK3β pathway. However, the actors responsible, in fine, for the remodeling of the cytoskeleton, essential for axonal growth, remain to be identified. CRMP1, 2 and 4 were initially characterized as actors of semaphorin 3A signaling, in which they regulate, among other things, neurite growth through their ability to act on the cytoskeleton. These proteins have the ability to bind with actin and modulate microtubule dynamics via their dephosphorylation/phosphorylation by GSK3β of which they are a substrate. These different elements make the CRMPs potential candidates for Seme3E signaling. Among these three CRMPs, only the absence of CRMP4 in neurons from the subiculum in culture blocks axonal growth in the presence of Seme3E. Furthermore, neuroanatomical analysis of CRMP4 mouse embryos reveals that these animals show abnormal development of the fornix post-commissure at birth, which persists into adulthood. A similar alteration of this tract is present in CRMP4/Sema3E double heterozygous mice, suggesting an interaction between these two genes and confirming the link between CRMP4 and Sema3E in vivo. Surprisingly, CRMP4 interacts with the PlxD1/Nrp1/VEGFR2 receptor complex only within membrane microdomains with a particular lipid composition, the detergent resistant membrane (DRM), and has already been characterized in guiding mechanisms. The addition of Sema3E to cultured subiculum neurons allowed us to demonstrate the inhibition of CRMP4 phosphorylation, downstream of the Akt/GSK3β pathway. Furthermore, we showed that the integrity of the DRMs as well as the cytoskeletal binding domain of CRMP4 was required for the growth-promoting activity of Sema3E, suggesting a role for CRMP4 at the interface between membrane Sema3E receptors and the cytoskeletal network. These different results highlight the essential role of CRMP4 in Sema3E signaling leading to fornix development and contribute to a better understanding of the molecular mechanisms involved in the specific establishment of neuronal connections during brain developmen