Interactions régulatrices et spécification du destin rénal

Les vertébrés ont développé des mécanismes variés de contrôle de l’expression des gènes au cours du développement et de la croissance de l’organisme. La régulation transcriptionnelle joue un rôle central dans l’établissement des réseaux de régulation génique qui sous-tendent l’organogenèse. Le rein des vertébrés s’établit en formant trois structures successives de complexité croissante au cours du développement : le pronéphros, le mésonéphros et le métanéphros. Chez l’amphibien Xenopus laevis, le pronéphros est constitué d’une seule paire de néphrons de grande taille et constitue le rein fonctionnel du têtard. Il est subdivisé en trois domaines distincts : le glomus, unité de filtration du sang ; le tubule, lieu de réabsorption des solutés et d’excrétion des déchets, et le tubule collecteur qui débouche dans le cloaque pour évacuer l’urine. Le tubule pronéphrique présente une segmentation structurale et fonctionnelle comme en témoigne l'expression différentielle de gènes codant différents transporteurs membranaires. Cette segmentation est similaire à celle observée pour le néphron des mammifères. La simplicité d’organisation du pronéphros, associée aux avantages expérimentaux de l’embryon de xénope, en fait un excellent modèle pour l’étude des réseaux gèniques impliqués dans le développement rénal des vertébrés. Les facteurs de transcription Pax2/Pax8 sont des régulateurs majeurs du développement rénal des vertébrés. De nombreux travaux réalisés chez la souris, le poissson zèbre et le xénope ont montré qu’ils étaient requis pour la spécification du lignage rénal, l’induction du du métanéphros, la ramification du bourgeon urétéral et la néphrogenèse. Toutefois, les mécanismes par lesquels Pax2/Pax8 contrôlent ces processus sont encore mal connus; en particulier, leurs gènes cibles ne sont que très partiellement identifiés. Chez le xénope, la perte de fonction de Pax8 conduit à une absence totale de tubule pronéphrique en raison d’un défaut de formation du champ pronéhrique. Ayant pour objectif d’identifier le réseau de régulation génique qui gouverne la mise en place du champ pronéphrique, nous avons entrepris une analyse transcriptomique afin de déterminer les cibles de Pax8 impliqués dans la spécification rénale. Nous montrons que les gènes hnf1b, evi1 et mnx1, tous trois codant pour des facteurs de transcription, sont régulés par Pax8. L’initiation de leur expression dans le champ pronéphrique au stade neurula est dépendante de Pax8. En utilisant une approche bioinformatique basée sur la conservation des séquences génomiques au cours de l’évolution, nous avons identifié une séquence conservée de 300 paires de bases (CNS1) localisée en amont du gène hnf1b portant un site de liaison à Pax8. En utilisant des tests de transactivation de gène rapporteur dans différentes lignées cellulaires et dans l’embryon, nous avons montré que cette séquence répond à Pax8 aussi bien dans un contexte de surexpression que dans le cas d’une expression endogène de Pax8. La mutation du site de liaison à Pax8 dans la séquence annule l’augmentation de l’activité du gène rapporteur. Ces résultats permettent de proposer que Pax8 régule l’expression de hnf1b dans le champ pronéphrique en se fixant à la séquence régulatrice CNS1. L’analyse détaillée et comparée des patrons d’expression de hnf1b, evi1 et mnx1 montrent qu’ils sont exprimés dans des domaines spécifiques du champ pronéphrique qui exprime Pax8. Afin de révéler l’existence de régulations croisées potentielles entre ces gènes, des expériences de gain et de perte de fonction ont été réalisées. La seule régulation mise en évidence est celle de evi1 par mnx1. Au total, nos résultats constituent une première étape dans l’identification du réseau de régulation génique à l’oeuvre dans la spécification du destin rénal chez les vertébrés.Vertebrate organisms have evolved various mechanisms to control the spatial and temporal patterns of gene expression during growth, differentiation and development. It has become increasingly obvious that the regulatory frameworks are highly dependent on the transcriptional regulation in metazoan organism. The vertebrate kidney develops as three spatially and temporally distinct excretory systems with increasing complexity: the pronephros, the mesonephros, and, finally, the adult kidney or the metanephros (Saxen, 1987). In amphibians, the pronephros is the functional kidney of the tadpole. In Xenopus laevis, it includes a pair of single, large, non-integrated nephron, on each side of the embryo. It can be subdivided into three distinct domains: the glomus, where the blood is filtered into the coelomic cavity, the tubules, where selective re-absorption and secretion is taking place, and the connecting tubule, which carries the waste the cloaca. The pronephric kidney is segmented into distinct domains of the mammalian nephron, as evidenced by the differential expression of several membrane transporter genes (Raciti et al., 2008; Zhou and Vize, 2004). In addition, the Xenopus renal primordium represents a unique system to study gene network organization due to its relative simplicity and the increasing number of genetic regulators identified as necessary for its development.In vertebrates, the transcription factors Pax8 and Pax2 are crucial regulators of kidney development. A large set of studies performed in mouse, zebrafish and Xenopus have demonstrated their requirement for the establishment of the renal lineage, along with metanephric kidney induction, branching morphogenesis and nephron differentiation. Yet, the mechanisms by which they operate and the genes they regulate are still elusive. In Xenopus, loss of Pax8 leads to a complete absence of pronephric tubule, due to a defect in kidney field organization. In an attempt to identify Pax8 downstream targets during renal specification, we compared the microarray screen profiles of Pax8-deficient pronephric cells to the wildtype’s and identified several deregulated genes, including hnf1b, evi1 and mnx1. Morpholino-mediated knockdown experiments evidenced that Pax8 has indeed an essential role in the onset of evi1 and mnx1 expression and is sufficient to activate evi1 expression in ectodermal animal cap cells, as previously shown for hnf1b. Using in silico approaches, we identified an evolutionary conserved non-coding sequence (CNS1) located ~30kb upstream hnf1b gene locus, encompassing a putative Pax8 recognition motif (BS1). Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) confirmed that this novel CNS1 directly interacts with Pax8. Using transfection assays in several kidney-derived cell lines, we demonstrate that luciferase activity driven by CNS1 was strongly up-regulated in response to either endogenous or exogenously added Pax8 and that this up-regulation is dependent on the presence of an intact Pax8-binding site. These findings suggest that Pax8 may regulate hnf1b1 expression through specific binding to the hnf1b CNS1, which may clarify the potential mechanism of Pax8 and hnf1b in nephrogenesis. Gene expression profile analysis revealed that evi1, hnf1b and mnx1 are expressed in a subset of the pax8 domain and in a specific region of the pronephric field in accordance with their known role in nephron patterning. We explored the potential cross-regulation between these transcription factors since it could contribute to establish their expression domain. Loss and gain-of-function experiments point to a genetic regulation between mnx1 and evi1, while no relationship can be observed between the other members. We view our results as a start toward building an eventually larger network of interactions between numerous directly and indirectly regulated molecular pathways that mediate specification and patterning of renal cells