Digestibilidade in vitro e toxicidade de lectinas vegetais para náuplios de Artemia sp.

The toxicity to Artemia sp. nauplius and the in vitro digestibility of lectins isolated from Canavalia ensiformis, C. brasiliensis, Cratylia floribunda, Dioclea guianensis, D. virgata and Artocarpus integrifolia seeds were studied. The results showed that the lectins isolated from Cratylia floribunda, Dioclea guianensis and D. virgata were the most toxic, leading to LD50 of 400, 450 and 450 µg/ml, respectively. The degree of toxicity decreased in presence of glucose, showing that the carbohydrate-specific binding sites were involved in the toxic mechanism. Direct immunofluorescence of the artemia nauplius pretreated with glucose/mannose lectins and FITC-antibody against Con Br revealed that these lectins attached to the nauplius surface. Nevertheless, no correlation was observed between the degree of lectin toxicity and the fluorescence intensity. The in vitro lectin digestibility was conducted with pepsin (2 hours) + trypsin and chymotrypsin (3 hours), both treatments in presence or absence of glucose, Ca++ and Mn++. The degree of digestibility was initially measured by SDS-PAGE but, because of the low resolution of this technique on quantifying the susceptibility of proteins to enzymatic treatments, it was replaced by molecular exclusion chromatography on Superose 12 HR 10/30 column, carried out on a FPLC system. The degree of digestibility was established by comparing the areas of the chromatograms obtained from untreated and hydrolysed lectins. The areas were calculated by trapezoidal proximation of the plotted chromatograms. The results show that glucose/mannose lectins were 53 to 84% digested. Contrary, jacalin showed to have a much high degree of resistance (> 90%). The tridimensional structure of jacalin was essentialy tetrameric (91%) at pH 8,1, while the glucose/mannose lectins predominated as dimers (72 - 96%). The presence of glucose Ca++ and Mn++ in the digestibility assay showed little importance on increasing the stability of lectins to enzymatic treatments. Dot-blotting analysis of glucose/mannose lectins demonstrated that many peptides fractions resulting from hydrolysis of these proteins were still recognized by the antibody raised against the native lectin from Canavalia brasiliensis (Con Br). No clear correlation was observed between the lectin digestibility and the toxicity to Artemia sp. nauplius.As lectinas purificadas a partir de sementes de Canavalia brasiliensis (Con Br), Canavalia ensiformis (Con A), Cratylia floribunda, Dioclea guianensis, Dioclea virgata e Artocarpus integrifolia (jacalina) foram estudadas quanto a toxicidade frente a náuplios de Artemia sp. e quanto a digestibilidade in vitro. Os resultados do bioensaio com artêmia demonstraram que as lectinas de Cratylia floribunda, Dioclea guianensis e D. virgata foram as mais tóxicas, apresentando DL50 de 400, 450 e 450 µg/ml, respectivamente. Essa toxicidade foi reduzida pela presença de glicose, revelando que o sítio de ligação a açúcar deve estar envolvido no mecanismo de toxicidade. A exposição dos náuplios de artêmia utilizados nos bioensaios com as lectinas glicose/manose específicas (todas, exceto a jacalina) ao anticorpo de coelho contra Con Br marcado com FITC, revelou que todos os náuplios apresentaram lectina aderida à sua superfície. Entretanto, não foi observada nenhuma relação entre a intensidade de fluorescência e o grau de toxicidade. A digestibilidade in vitro das lectinas foi estudada a partir de exposição à pepsina durante duas horas, e à pepsina (2 h) + tripsina e quimotripsina (3 h), ambos os tratamentos na presença e ausência de glicose, Ca++ e Mn++. O grau de digestibilidade foi medido inicialmente por eletroforese e posteriormente substituído por cromatografia de exclusão molecular em coluna de superose 12 HR 10/30, acoplada a sistema FPLC. Os gráficos obtidos foram plotados e as áreas calculadas a partir de aproximação trapezoidal. Os resultados demonstraram que as lectinas glicose/manose específicas apresentaram graus de digestibilidade de 53 a 84%. A jacalina foi extremamente resistente à proteólise, sendo preservada em mais de 90%. Em pH 8,1, essa lectina apresentou-se essencialmente na forma tetramérica (91%), enquanto as lectinas glicose/manose especificas apresentaram-se principalmente na forma dimérica (de 72 a 96%). A presença de glicose, Ca++ e Mn++ parece ter sido pouco importante no aumento da resistência das lectinas glicose/manose específicas. O "dot-blotting" realizado com as frações dos hidrolisados enzimáticos revelou que uma boa parte dos peptídeos resultantes do tratamento proteolítico das lectinas glicose/manose específicas ainda preservou epítopos imunologicamente reconhecidos pelo anticorpo contra Con Br. Não foi observada nenhuma relação clara entre o grau de digestibilidade e a toxicidade para náuplios de Artemia sp