Caracterização estrutural de três lectinas apresentando especificidades por açúcar distintas, isoladas de sementes de Fruta Pão (Artocarpus incisa L.)

Three lectins from Artocarpus incisa L. seeds, showing different sugar-binding properties, were efficiently isolated and purified by affinity chromatography. The D-galaetose-binding lectin was isolated on an Adenanthera pavonina L. cross-linked galactomannan while the D-mannose-binding leetin was isolated on agarose-mannose and the chitin binding lectins was isolated on chitin columns. These lectins were named FRUTALlN, FRUTAPIN e FRUTACHIN,respectively. The three leetins showed hemagglutinating activities against animal and human ABO system red blood cells, although with no apparent group specificity. With respect to their structure, the three leetins showed some peculiarities. When the apparent molecular masses (Mr), determined by gel filtration on Superdex 75 HR, in the presence of D-galactose and D-glucose were determined, while frutalin and frutapin showed values of 60 kDa, frutachin showed a value of 12 kDa. On the other hand, by PAGE-SDS, frutalin showed two bands (15 and 12 kDa) while only one band was found both for frutapin (13 kDa) and frutaehin (6.5 kDa). These data suggest that frutalin and frutapin are tetramers and frutachin a dimmer. Frutalin and frutapin showed a very similar amino acid composition, with high contents of glycine and acidic and hydroxylated residues and absence of cysteine while frutachin showed a very high content of this amino acid (more than 14%). The secondary structures of the three leetins were showed to be predominantly B, with no significant a-helix, although frutapin and frutachin did not show CD spectra characteristics of B-structure. The frutalin and frutaehin N-terminal amino acid sequences were determined and submitted to alignment (BLAST data bank); while frutalin showed more than 90% of identity with jacalin, frutachin showed identity with no leetin deseribed. Thus frutachin may constitute a new lectin family. The stability of frutalin quaternary structure, with to pH, was investígated by gel filtration, in the presence and absence of D-glucose and D-galactose. The presenee of these sugars stabilized the strueture of the lectin. The effects of these two sugars, structurally non related, suggest that frutalin must recognize both monosaccharides, and allow us to define a new subdivision for the leetins, the MULTILECTINS, or proteins composed by carbohydrate-binding domains, whieh are identical or highly homologous, but recognizing structurally non related sugars. Thus, lectins showing multivalent specificity should be induded in this class.Três lectinas de sementes de Artocarpus integrifolia L., com especificidades distintas foram eficientemente isoladas e purificadas por cromatografia de afinidade. A lectina D-galactose-ligante foi isolada em coluna de galactomanana de Adenanthera pavonina, a lectina D-manose-Iigante em coluna de agarose-manose e a lectina quitina-ligante foi isolada em coluna de quitina. Estas lectinas foram denominadas de FRUTALINA, FRUTAPINA e FRUTAQUINA, respectivamente. Elas são capazes de aglutinar hemácias de animais e humanas do sistema ABO, não sendo específicas para nenhum grupo. As lectinas de sementes de Artocarpus integrifolia L. foram caracterizadas estruturalmente. A massa molecular aparente determinada por filtração em gel em coluna Superdex 75 HR, em presença de D-galactose 0,2 M e D-glucose 0,2 M, para a frutalina e frutapina foi de aproximadamente 60 kDa, enquanto que a frutaquina apresentou uma Mr em tomo de 12 kDa. Por PAGE-SDS a frutalina apresentou duas bandas protéicas de 15 e 12 kDa, a frutapina e frutaquina apresentaram uma única banda protéica de 13 e 6,3 kDa, respectivamente. Conciliando os dados de filtração molecular e os obtidos em PAGE-SDS podemos sugerir que as subunidades monoméricas da frutalina e frutapina se associam formando um tetrâmero, e as da frutaquina formando um dímero. A frutalina e a frutapina têm uma composição de aminoácidos rica em aminoácidos ácidos e hidroxilados, um alto conteúdo de glicina e ausência de cisteína, por outro lado, a cisteína é um aminoácido abundante na frutaquina, representando mais de 14% do total. A estrutura secundária das três lectinas é predominantemente composta por estrutura B, não apresentando a-hélice, embora a frutapina e frutaquina não apresentem espectros de dicroísmo circular característico de estrutura B. A seqüência N-terminal da frutalina e frutaquina foi determinada e, quando estas foram submetidas ao alinhamento do banco de dados BLAST, a frutalina apresentou uma alta identidade com a jacalina, mais de 90%, e com outras lectinas jacalina relacionadas enquanto a frutaquina não apresentou identidade estrutural com nenhuma lectina até o momento seqüenciada. Desta forma ela deve constitui uma nova família de lectina. A estabilidade da estrutura quaternária da frutalina foi avaliada em função do pH, na presença e ausência de D-galactose e D-glucose. O efeito da variação do pH na estrutura da frutalina foi monitorado por cromatografia de exclusão molecular, verificando-se que os açúcares, de alguma maneira, estabilizaram a estrutura tetramérica da frutalina. O efeito destes dois monossacarídeos mostrou que a frutalinà é uma lectina de especificidade múltipla, ou seja, ela reconhece monossacarídeos estruturalmente não relacionados. Assim, propomos uma nova subdivisão para as lectinas, LECTINAS MULTIVALENTES, proteínas constituídas exclusivamente de domínios ligantes a carboidratos que são idênticos ou muito homólogos, mas que reconhecem açúcares não relacionados estruturalmente. Assim, lectinas que apresentam especificidade múltipla, estariam enquadradas nesta classe